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1.背景

阿尔茨海默病（AD）的诊断和分期标准近期已更新，纳入了更多生物标志物，例如神经炎症和血管因素。淀粉样蛋白-β（Aβ）与 tau 蛋白聚集病理以及以萎缩为代表的神经退行性标志物，共同构成了 AD 的 Aβ/tau/神经退行性变（A/T/N）标准，这一研究框架仍在不断扩展。考虑到 AD 可能始于不同的神经病理过程或存在共病因素，有必要揭示与临床症状密切相关的神经病理标志物的进展模式。

在 AD 的发病机制中，细胞萎缩会减少脑组织体积分数，降低与神经突结合的水分，并增加自由水。神经影像中的多室扩散模型可基于水分子在细胞内、细胞外及脑脊液室中扩散的差异，估算自由水分数（FWF），该指标代表细胞外水体积。FWF 是一个敏感的微结构标志物，其改变先于脑形态学萎缩。FWF 反映白质（WM）微结构的完整性，在认知下降过程中会升高。AD 中 WM FWF 的升高与类淋巴功能受损及脑脊液中 Aβ42（42 个残基的 Aβ 亚型）水平降低相关。然而，WM FWF 变化的时空轨迹仍不清楚。此外，AD 核心病理（如 Aβ 沉积）与近皮质 WM FWF 变化之间的时空关系也需进一步阐明。

灰质与白质组织区室在灰白质交界边界处紧密相邻。靠近灰白质交界区域的微结构已显示出与衰老和 AD 的相关性。据我们所知，灰白质交界下方近皮质 WM 中 FWF 的时空变化在 AD 中尚未被研究。近皮质 WM 中 FWF 的时空模式变异可能指示独特的潜在 AD 病理。

此研究旨在评估近皮质 FWF、其与神经病理严重程度的关联，以及其在伴 AD 或认知正常受试者中使用 MRI 和 PET 所呈现的时空模式。

2.材料与方法

2.1研究样本

研究样本来自 RJNeuroBank-痴呆前瞻性队列的受试者。受试者于 2021 年 11 月至 2024 年 7 月期间被招募至一项针对全因痴呆的观察性队列中，该研究已获当地伦理委员会批准（附录S1）。所有受试者均提供了书面知情同意书。该队列已在 ClinicalTrials.gov 注册（标识符 NCT05623124）。更多细节及既往报告见附录 S1。

若受试者至少有一次包含 T1 加权 MRI 扫描的就诊记录，且具备可用的多壳扩散 MRI 和 Aβ PET 扫描数据，则初步纳入研究样本。随后，若受试者被诊断为认知正常，或通过PET 成像显示脑 Aβ 病理异常证据而被诊断为因 AD 所致的轻度认知障碍和痴呆，则被纳入。因 AD 所致的轻度认知障碍和 AD 痴呆被统一定义为 AD 连续谱，以下简称为 AD 组，以反映 AD 病理的渐进性临床和生物学进展。主要诊断为认知正常、轻度认知障碍或因 AD 所致痴呆以外的受试者被排除出研究（图 1）。痴呆和轻度认知障碍的诊断标准依据 2016 年美国国立老化研究所-阿尔茨海默病协会工作组制定的指南。

受试者接受了神经心理学评估，包括用于评估整体认知的简易精神状态检查（MMSE）（中文版）、用于评估记忆的 5 分钟听觉词语学习测验、用于评估语言的言语流畅性测验（VFT）和波士顿命名测验，以及用于评估执行功能的形状-连线测验 A 和 B 部分。神经心理学评估用于临床表型分类（附录 S1）。在纵向分析中，纳入了 36 名具有 12 个月随访 MRI 扫描和神经心理学评估的 AD 受试者，以评估亚型与阶段推断（SuStaIn）模型亚型和阶段分配的纵向一致性。

2.2影像采集

此二次分析中使用的多模态 MRI 方案源自 RJNeuroBank-痴呆前瞻性队列研究，包括3D高空间分辨率 T1 加权（体素大小= 1×1×1 mm³）、3D T2 加权液体衰减反转恢复序列以及多壳扩散 MRI，这些序列能够评估脑结构和微结构完整性，包括 FWF。MRI 预处理流程大体遵循英国生物银行开发的图像处理管道协议。PET 成像使用氟18（¹⁸F）-florbetapir 和 ¹⁸F-MK-6240 示踪剂，通过 PET/CT 扫描仪分别测量皮层淀粉样蛋白和 tau 蛋白沉积。MRI 和 PET 扫描采集及预处理的细节见附录 S1。

2.3图像处理

皮层厚度和海马体积使用 FreeSurfer 标准流程（版本 7.1.1）进行测量。多壳扩散 MRI 数据使用功能性磁共振成像脑软件库的“DTIFIT”函数处理生成扩散张量图，得到一组图像，包括平均扩散率和各向异性分数。FWF 通过基于多壳扩散 MRI 数据的神经突方向离散度与密度成像模型进行定量测量。皮层厚度、各向异性分数、平均扩散率和 FWF的区域测量值使用 Desikan-Killiany 图谱（FreeSurfer）提取。处理细节见附录 S1。

2.4 SuStaIn 算法

采用无监督学习算法 SuStaIn 分析 AD 中 FWF 的多样化进展模式。该工具已在多项基于 SuStaIn 的 AD 生物标志物研究中应用。本文中使用的两种 SuStaIn 模型（FWF模型和FWF加 Aβ模型）的 SuStaIn 方法细节见附录 S1。

简言之，FWF 模型仅关注 FWF 感兴趣区变量，以揭示 AD 连续谱中近皮质 WM 微结构变化的时空模式（附录 S1，图 S1），而 FWF 加 Aβ 模型整合了区域 FWF 测量值和Aβ 皮层标准化摄取值比，以探索 FWF 与 Aβ 之间的时空关系。区域 FWF 和 Aβ 测量值是由Desikan-Killiany 图谱中划定的若干感兴趣区组合而成（详见表 S1）。纵向 MRI 扫描用于评估 FWF 模型中SuStaIn 亚型的一致性和 SuStaIn 阶段随时间的进展（附录 S1）。

图1流程图展示了研究参与者的纳入与排除标准

2.5统计分析

统计分析和数据可视化使用 R（版本 4.2.0）完成。脑统计图使用 FreeSurfer Viewer 生成。采用夏皮罗-威尔克检验评估数据正态性。符合正态分布的连续变量使用两样本 t 检验比较。对于非正态分布的变量，应用曼-惠特尼检验。分类变量使用 χ² 检验比较。使用线性回归模型（产生b值）进行组间比较、检验区域 FWF 值与临床特征之间的关联，以及评估 SuStaIn 阶段与临床特征之间的关联。所有线性回归模型均校正了相关协变量，包括年龄、性别、认知状态（轻度认知障碍或痴呆）、受教育年限，并在适当情况下校正 SuStaIn 阶段。此外，比较了随访期间 SuStaIn 亚型稳定与不稳定个体之间基线时的亚型和阶段概率。

为说明原始样本与分半分析中亚型间 FWF 差异的一致性，使用校正了 SuStaIn 阶段的广义线性模型进行了顶点水平的比较分析。亚型间的纵向差异使用变化值（随访减基线）和单因素方差分析进行评估。统计学显著性水平设为双侧 P < 0.05。必要时，使用本杰明-霍赫伯格方法对多重比较进行错误发现率（FDR）校正，具体在结果部分说明。

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3.结果

3.1受试者特征

从最初的 434 名受试者中，排除了 75 名主要诊断为认知正常、轻度认知障碍或因 AD 所致痴呆以外的受试者（图 1）。最终共 359 名受试者（平均年龄 69 ± 8 岁；年龄范围 40–86 岁；223 名女性）被纳入研究样本。

受试者的人口统计学特征总结于表中。在 359 名受试者中，198 名具有认知症状且经 PET 专家评估为 Aβ 阳性的受试者被定义为 AD 连续谱组（以下简称 AD 组；平均年龄 71 ± 8 岁；120名女性）。AD 组内，85 名为轻度认知障碍个体，113 名为痴呆个体。同时，161 名认知正常且 PET 显示 Aβ 阴性的受试者被定义为对照组。与认知正常对照组相比，AD 组受试者年龄更大、接受正规教育年限更短、MMSE 评分更低（均 P < 0.001）。AD 组详细的神经心理学评估总结于表 S2。

表1研究参与者的人口统计学特征

3.2 AD 受试者与认知正常受试者之间FWF的比较

首先，使用校正了年龄和性别的协方差分析，比较了AD 组与对照组之间皮层厚度、常规扩散指标（各向异性分数和平均扩散率）以及皮层和近皮质WM中FWF 的区域测量值（图 2A）。全脑范围内，近皮质 WM FWF 的平均效应量高于皮层FWF（偏η²= 0.065 vs 0.023；P < 0.001），也高于皮层和近皮质各向异性分数及平均扩散率（皮层各向异性分数和平均扩散率分别为0.009和0.005；近皮质各向异性分数和平均扩散率分别为0.016和0.005；均 P < 0.001）。此外，近皮质 WM FWF 的效应量大于皮层厚度（0.065 vs 0.047；P = 0.01）。

与对照组相比，AD 组在多个脑区显示出 FWF 值升高，包括扣带回、额叶、眶额叶、楔前叶、外侧顶叶、外侧和内侧颞叶以及枕叶（例如，眶额叶，AD 组 = 0.246 ± 0.056，对照组 = 0.197 ± 0.046；FDR 校正后 P 值范围，P < 0.001 至 P = 0.049）（图 2B、S2；附录 S1；表 S3）。

3.3 AD 中 FWF 与皮层淀粉样蛋白和 tau蛋白沉积、皮层厚度及神经心理学评估的关联

使用校正了年龄、性别和认知状态（轻度认知障碍或痴呆）的线性回归模型，在 Desikan-Killiany 图谱定义的 68 个皮层区域中，较高的 FWF 显示出与较高的皮层 Aβ 和tau 沉积以及较低的皮层厚度相关（图 3A）（P 值见附录 S1）。当聚焦于七个感兴趣区（包括扣带回、额叶、眶额叶、楔前叶、外侧顶叶、颞叶和枕叶皮层，表 S1）时，除了 FWF 与皮层整体Aβ（b 值范围，1.44–3.54；FDR 校正后 P 值范围，P < 0.001 至 P = 0.04）和 tau（b 值范围，1.94–4.80；FDR 校正后 P 值范围，P < 0.001 至 P = 0.01）沉积呈正相关外，较高的 FWF 还与较低的 MMSE 评分相关（b 值范围，-41.57至 -9.02；FDR 校正后 P 值范围，P < 0.001 至 P = 0.003）（图 3B）。除整体认知外，FWF 与特定认知领域的神经心理学测验评分（包括听觉词语学习测验、VFT、波士顿命名测验和形状-连线测验）的关联见附录 S1 和表S4。

3.4亚型进展模式

将 SuStaIn 算法应用于七个基线 FWF 感兴趣区测量值，识别出两种具有不同 FWF 变化进展模式的亚型（图 4A, 4B）。图 4C 描绘了交叉验证信息准则（较低的交叉验证信息准则值表示 SuStaIn 建模中模型拟合更好、泛化能力更强）。第一种亚型“楔前叶-首发型”的早期改变出现在楔前叶、外侧顶叶和枕叶皮层，而第二种亚型“眶额叶-首发型”的早期改变则领先出现在眶额叶皮层。两种亚型在后期阶段均出现广泛的 FWF 改变（图 4B）。除这两种亚型外，被分配至 SuStaIn 阶段 0 的个体被标记为“外观正常组”，其未显示可检测的 FWF改变（在AD 组的 198 名受试者中：阶段 0，n = 57；楔前叶-首发亚型，n = 91；眶额叶-首发亚型，n = 50）。各认知状态在阶段和亚型间的分布见图 4D 和 4E。总体而言，认知损害更严重的个体被更确信地分配至某种亚型（图 4F）。每种亚型在各 SuStaIn 阶段的亚型分配概率见图 4G。在这两种亚型中，仅选择具有高亚型分配概率（概率 > 70%）的案例进行后续亚型分析（图4G）（楔前叶-首发亚型：91 例中的 73 例 [80%]；眶额叶-首发亚型：50 例中的 37 例 [74%]）。

图2阿尔茨海默病（AD）患者与认知正常对照组基线期扩散测量值比较

3.5亚型的临床特征

眶额叶-首发亚型的女性受试者比例低于楔前叶-首发亚型（b = -1.4；P < 0.001）（表 S5）。未发现两种亚型间轻度认知障碍受试者比例的差异证据。使用线性回归模型进行组间比较，并校正了年龄、性别、认知状态（轻度认知障碍或痴呆），以及在适当情况下校正 SuStaIn 阶段。认知表现分析进一步校正了受教育年限。尽管两种 SuStaIn 亚型显示出不同的 FWF 变化模式，但其在神经病理和临床特征方面存在重叠，包括皮层淀粉样蛋白和 tau 沉积（分别为 P = 0.61 和 0.22）、皮层厚度（左侧，P = 0.64；右侧，P = 0.96）及年龄（P = 0.28）（图 5A，表 S5）。然而，与楔前叶-首发亚型相比，眶额叶-首发亚型具有更小的海马体积（校正了预估颅内总体积）（左侧，眶额叶-首发亚型：0.18 ± 0.03，楔前叶-首发亚型：0.20 ± 0.03；b = -0.1，P = 0.007；右侧，眶额叶-首发亚型：0.20 ± 0.03，楔前叶-首发亚型：0.21 ± 0.04；b = -0.08，P = 0.03）以及更差的认知表现（VFT，眶额叶-首发亚型：5.76 ± 3.78，楔前叶-首发亚型：7.10 ± 2.97；b = -0.21，P = 0.01；形状-连线测验 A 部分，眶额叶-首发亚型：125.00 ± 65.57，楔前叶-首发亚型：108.66 ± 60.40；b = 0.16，P < 0.001）。SuStaIn 推断的影像亚型与临床分类（例如，记忆主导型或执行/语言主导型表型）的一致性见附录 S1 和表 S6。

3.6 SuStaIn 阶段与临床特征的关系

使用最大似然法，每名受试者被分配到一个 SuStaIn 阶段，该阶段反映了 FWF 变化的进展程度。使用线性回归模型（校正了年龄、性别和认知状态等协变量）总结的 SuStaIn 阶段与临床及神经病理特征之间的关系见图 5B。认知表现分析进一步校正了受教育年限。在两种亚型中，年龄均与 SuStaIn 阶段无关联。两种亚型中，皮层厚度均与 SuStaIn 阶段呈负相关（b 值范围，-0.009 至 -0.01；P 值范围，P < 0.001 至P = 0.003）。在楔前叶-首发亚型中，SuStaIn 阶段与皮层淀粉样蛋白沉积（b = 0.03；P = 0.03）、tau蛋白沉积（b = 0.05；P < 0.001）、右侧海马体积（b = -0.008；P = 0.041）及认知表现（MMSE 评分，b = -0.02；波士顿命名测验，b = -0.02；VFT，b = -0.03；形状-连线测验，b = 0.03；均 P < 0.001）相关。图 5C 展示了两种亚型中 FWF 及皮层淀粉样蛋白和 tau 沉积随 SuStaIn 阶段变化的推断轨迹。

图3阿尔茨海默病患者中自由水分数（FWF）与大脑皮层淀粉样蛋白及tau蛋白沉积、皮层厚度及简易精神状态检查量表（MMSE）的相关性

图4基于亚型与分期推断（SuStaIn）模型对疾病进展模式进行建模，采用七个自由水分数（FWF）区域感兴趣变量来识别两种亚型。

3.7模型稳定性与亚型随时间演变趋势

当使用研究样本中不同样本量初始化时，SuStaIn生成的亚型几乎完全相同（附录S1，图S3）。36 名随访 AD 受试者的亚型分配见图 S4A。总体而言，36 名受试者中有27 名（75%）在基线和随访时表现出相同的亚型，或从阶段 0（外观正常组）进展至另一种亚型（图 S4B）。基线与随访之间阶段（在 ±2 范围内）的一致性为 36 例中的 26 例（72%），且在两个方向上均观察到变异性。此外，基线时的 SuStaIn 阶段与随访时的阶段高度相关（r = 0.89；P < 0.001）（图 S4C）。在随访时亚型稳定与不稳定的受试者之间，未观察到亚型和阶段分配概率的差异证据（图 S4D）。

在具有纵向随访数据的 36 名受试者中，22 名在基线时被分类为楔前叶-首发亚型，8 名为眶额叶-首发亚型。在 1 年随访时，两种亚型在整体认知和海马体积方面表现出相似的变化（表 S7）。

图5SuStaIn亚型间临床特征比较及进展分析

图5SuStaIn亚型间临床特征比较及进展分析

3.8淀粉样蛋白-首发与 FWF-首发亚型

将 SuStaIn 算法应用于基线 FWF 和 Aβ 测量值，识别出两种具有不同进展模式的亚型（图 6A）。淀粉样蛋白-首发亚型在 FWF 之前出现淀粉样病理的早期改变，而 FWF-首发亚型则以 FWF 的早期改变先于淀粉样病理为特征（在 AD 组的 198 名受试者中：阶段0，n = 7；淀粉样蛋白-首发亚型，n = 143；FWF-首发亚型，n = 48）。图 6B 描绘了交叉验证信息准则。每种亚型在各 SuStaIn 阶段的亚型分配概率见图 6C。仅选择具有高亚型分配概率（> 70%）的案例进行后续分析（淀粉样蛋白-首发亚型，143 例中的 137 例 [96%]；FWF-首发亚型，48 例中的 40 例 [83%]）。

两种亚型的临床特征总结于图 6D 和表 S8。与 FWF-首发亚型相比，淀粉样蛋白-首发亚型的受试者受教育年限更长（b = -1.3；P = 0.03），且轻度认知障碍受试者比例更高（b = 1.5；P < 0.001），这些因素均在后续分析中进行了校正。未发现两种亚型在年龄、性别、MMSE 评分、皮层 tau 沉积及海马体积方面的差异证据。淀粉样蛋白-首发亚型的皮层淀粉样蛋白沉积水平更高（b = -0.3；P < 0.001），而 FWF-首发亚型的认知表现更差，体现在波士顿命名测验（b = -0.18；P < 0.001）、VFT（b = -0.17；P = 0.02）及形状-连线测验（b = 0.20；P < 0.001）上。FWF-首发亚型的左侧皮层厚度也低于淀粉样蛋白-首发亚型（b = -0.05；P = 0.01）。

图6通过亚型与分期推断（SuStaIn）模型，结合自由水分数（FWF）和淀粉样蛋白感兴趣区域变量对疾病进展模式进行建模，从而识别出两种亚型。

4.讨论

在此研究中，使用了数据驱动的亚型与阶段推断（SuStaIn）模型，利用来自 MRI 和 PET 的横断面 FWF 数据，探究了阿尔茨海默病受试者近皮质白质中自由水分数（FWF）的时空进展模式。SuStaIn 模型揭示了两种不同的 FWF 改变模式；与楔前叶-首发亚型相比，眶额叶-首发亚型具有更小的海马体积（左侧，P = 0.007；右侧，P = 0.03）和更差的认知表现（言语流畅性测验，P = 0.01；形状-连线测验 A 部分，P < 0.001）。在整合 FWF 和淀粉样蛋白-β（Aβ）数据的第二个 SuStaIn 模型中，此研究识别出独特的 FWF 和 Aβ 进展模式，即“淀粉样蛋白-首发亚型”和“FWF-首发亚型”，每种亚型在神经退行性变和认知功能特征方面均表现出差异。

作为脑微结构的一种生物标志物，FWF 据报道在 AD 患者的皮层和皮层下区域广泛升高。AD中高WM FWF 被报道与较低的脑脊液 Aβ42 水平以及所有认知领域（尤其是记忆）的更差认知表现相关。此外，FWF与PET 中颞叶 tau 蛋白积聚呈正相关。此研究证实并扩展了这些发现，表明近皮质WM中 FWF 的升高与 A/T/N 标志物相关，包括升高的皮层 Aβ 和tau 标准化摄取值比、降低的皮层厚度，以及更差的认知表现，特别是在记忆和语言相关领域。总体而言，此研究结果支持WM FWF作为 AD 一个有前景的生物标志物。考虑到先前报道的大鼠模型中FWF与神经炎症的关联，未来的研究若能将 FWF 与遗传数据整合，将有助于阐明其潜在的生物学机制。

此研究识别出近皮质WM中FWF变化的两种不同时空进展亚型。在 AD 的初始阶段，楔前叶是淀粉样斑块和神经原纤维缠结最易受损的区域之一。楔前叶作为功能性默认模式网络的核心节点，是tau 病理和神经炎症沉积的主要部位。此研究发现表明，一部分AD患者在AD早期阶段其楔前叶对微结构变化具有更高的易损性。此外，此研究关于FWF亚型的发现与先前一项关于淀粉样蛋白亚型的SuStaIn 研究一致，该研究识别出一种额叶主导型亚型，其中淀粉样蛋白最初积聚在内侧眶额区域，随后出现另一种以楔前叶和后扣带回早期淀粉样蛋白沉积为特征的亚型。

据报道，使用扩散 MRI 测量的微结构变化与星形胶质细胞对 Aβ 聚集的反应有关。可能由于样本量有限，此研究的 FWF 加 Aβ SuStaIn 模型未能提供关于 FWF 与 Aβ 变化区域同步性的额外信息。然而，此研究结果表明，微结构变化可能先于或后于 Aβ 沉积，提示这两种过程之间存在双向关系。此外，此研究发现 FWF-首发亚型的受试者比淀粉样蛋白-首发亚型具有更差的认知表现和更低的皮层厚度。此研究结果与 AD 诊断和分期的修订标准一致：Aβ 阳性个体中存在共存的病理异常，可能导致神经退行性变和临床症状的出现早于 AD 的典型进展。

此研究存在局限性。首先，在1年随访期内未观察到 FWF 亚型之间临床进展的差异；鉴于微结构变化与Aβ沉积之间的联系，未来研究中更长随访时间及更大样本量有望提供更多见解。其次，尽管 SuStaIn 以精细的亚型-阶段方式对疾病进展建模，但由此产生的大量亚型-阶段组合与中等样本量可能引发对潜在过拟合的担忧。尽管此研究仅纳入具有高亚型分配置信度（> 70%）的受试者进行下游分析以确保稳健性，但仍需在更大规模的独立队列中进行进一步验证，以确保亚型-阶段特征的普适性。第三，36 名 AD 受试者中有 6 名从基线的特定亚型转变为随访时的外观正常亚型，这可能由于随访样本有限，凸显了在更大数据集中验证此SuStaIn模型的必要性。第四，尽管两聚类方案对于捕捉FWF的时空模式是最优的，但可能存在更细微和独特的亚型，值得未来探索。第五，线性回归分析的 P 值对于残差显著偏离正态性的结局指标可能仅为近似值。最后，尽管先前研究已将SuStaIn 应用于多模态数据集，但此研究中将MRI衍生的FWF与淀粉样蛋白PET整合在单一SuStaIn 模型内可能引入尺度相关偏倚，需通过替代建模进行进一步验证。

5.结论

总之，使用扩散 MRI 测定的近皮质自由水分数（FWF）在阿尔茨海默病（AD）受试者中较对照组升高，并与淀粉样蛋白-β、tau 蛋白及神经退行性变生物标志物相关，揭示了两种不同的时空进展模式，对神经解剖学特征和认知表现具有不同影响。此外，此研究观察到一部分 AD 受试者的白质（WM）FWF 改变先于淀粉样病理改变。这些发现凸显了近皮质 WM 中的自由水作为 AD 发病机制的一个重要因素，为补充对淀粉样蛋白沉积的理解提供了新见解。未来需要更大样本量的纵向研究，以进一步阐明这些 FWF 亚型与 AD 病理之间的关系。