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1.引言

神经精神症状（NPSs）是阿尔茨海默病（AD）连续谱中常见且重要的临床表现，其过程复杂且具有高度异质性。在 AD 进展过程中，约 90% 的患者会经历一种或多种神经精神障碍，这加剧了 AD 个体的整体功能恶化，并增加了照护者负担。尽管 NPSs 患病率高且影响深远，但它并未被纳入任何 AD 诊断范式中，且 NPSs 与AD 病理生理机制之间的相互关系仍未完全阐明。近期研究揭示，NPSs 在 AD 所有临床阶段均普遍存在，但在任一临床阶段，其与认知功能随时间的变化均无关联。NPSs的复杂性阻碍了对其在 AD 中作用的理解，因此也不利于循证干预措施的制定。鉴于此，有必要将 NPSs 聚类为具有特定特征的有意义的症状组。

神经科学的一个基本假设是，脑网络连接决定了脑的功能组织。活体脑的神经影像连接为识别驱动认知和行为神经生物学的因素提供了契机。神经影像方法的最新进展揭示，病理性蛋白沿着特定的宏观脑网络积聚，表明脑网络架构参与了神经退行性疾病系统层面的病理生理过程。脑网络异常可为区分这些神经退行性疾病之间及其内部的蛋白病理提供活体特征。这一证据为通过宏观脑连接组来阐明 AD 连续谱中 NPSs 的复杂性和异质性提供了新的见解。

脑结构观察揭示了被称为结构协变网络的协变模式，该模式最近已成为一种有前景的方法，可将多种结构神经影像特征融合为具有生物学意义的、个体特异性的连接组。区域放射组学相似性网络（R2SN）是一种新颖且稳定的网络，有助于理解人类形态学协变，并基于结构神经影像探索生物学机制。它已成功用于研究AD 相关痴呆中的脑网络功能障碍，并揭示潜在的生物学特征。

因此，此研究旨在探究 AD 连续谱中与 NPSs 相关的R2SN 连接，并开发一个数据驱动的亚型划分框架，以描绘伴 NPSs 的 AD 患者的不同亚型。此研究对 NPS 亚型聚类的稳定性和可重复性进行了内部和外部验证。随后，此研究在这些 NPS 亚型中探索了 AD 的多组学特征，包括临床表现、血浆病理生物标志物、多模态神经影像负荷及临床进展。此外，此研究还评估了支撑不同 NPS 亚型的生物学机制，以及它们与导致 AD 连续谱的生物学通路之间的联系。

2.材料与方法

2.1研究设计与受试者

此研究纳入了来自中国影像、生物标志物与生活方式（CIBL）研究的 AD 连续谱患者，其中伴 NPSs（AD-NPS）者 376 名，不伴 NPSs（AD-nNPS）者 111 名，以及正常对照（NC）受试者 63 名。该 CIBL 研究于 2021 年 1 月 1 日至 2023 年 2 月 28 日期间进行，已获首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准（批准号：KY-2021-028-01）。所有受试者或其法定授权照护者在了解研究目的后均签署了书面知情同意书。

此研究纳入的 AD 连续谱患者包括轻度认知障碍（MCI）和 AD 痴呆（发病年龄 ≥ 60 岁）；前者采用 Petersen 遗忘型 MCI 诊断标准或 2018 年美国国立老化研究所-阿尔茨海默病协会工作组因 AD 所致 MCI 诊断标准，后者采用2011 年或 2018 年美国国立老化研究所-阿尔茨海默病协会工作组很可能的 AD 或确诊 AD 诊断标准。其中，168 名（44.92%）患者具有符合AT(N)（淀粉样蛋白/tau/神经退行性变）框架的病理生物标志物结果，包括 27 份脑脊液生物标志物、6 份正电子发射断层扫描/计算机断层扫描标志物及 135 份血浆生物标志物。

所有 NC 受试者均 ≥ 50 岁，认知正常，无任何可能影响认知的其他疾病的一般或实验室证据，且无任何神经精神症状。详细的纳入和排除标准见补充材料 S01。研究设计与数据分析见图 1。

2.2临床数据收集与评估

收集了人口统计学和临床特征方面的临床数据，包括年龄、性别、受教育年限、婚姻状况、病史及 APOE ε4 等位基因状态。还进行了全面的神经心理学评估，包括简易精神状态检查（MMSE）、蒙特利尔认知评估（MoCA）、神经精神量表、日常生活活动能力量表、简易营养评估量表（MNA）、照护者负担量表及匹兹堡睡眠质量指数。各神经心理学量表的内容及标准详见补充材料 S02。

2.3血浆病理生物标志物

共 135 名 AD 连续谱患者接受了血浆病理生物标志物检测。使用 BD FACSCanto II 流式细胞仪（BD 生物科学公司）测量了血浆中 40 和 42 个氨基酸长的淀粉样蛋白-β（Aβ）片段（Aβ40 和 Aβ42）、苏氨酸 181 位点磷酸化 tau 蛋白（p-tau181）及总 tau 蛋白（t-tau）的浓度。测量在一轮实验中使用同一批次试剂完成，分析人员对诊断和临床数据保持盲态。

2.4多模态神经影像数据采集与分析

所有受试者均使用 3T 磁共振扫描仪（SIGNA Premier；GE 医疗）及 48 通道头线圈，进行了结构3D T1 加权成像及 7 延迟伪连续动脉自旋标记图像采集。采用开源软件 CAT12（v12.8）对每位受试者的 T1 加权图像进行分割，并根据 Brainnetome 图谱计算脑区灰质（GM）体积和皮层厚度。此外，从预处理后的伪连续动脉自旋标记图像中提取了脑区校正脑血流量（cCBF）。考虑到 cCBF 空间分辨率较低，cCBF 值采用第三版自动化解剖图谱（178 个脑区）进行提取。多模态神经影像参数及计算过程详见补充材料 S03。

2.5个体化 R2SN 构建

为全面评估脑连接组模式，此研究引入了一种名为 R2SN 的新型稳定形态学协变网络，该网络已成功用于反映基于结构 T1 加权磁共振成像数据的脑连接组变化。个体化 R2SN 使用开放获取工具包构建。首先使用高级标准化工具将每位受试者的3D T1 加权磁共振图像对齐到MNI空间。然后，针对 Brainnetome 图谱定义的 246 个脑区提取了一系列影像组学特征。此处，每个脑区提取了 22 个影像组学特征。详细内容见补充材料 S04。最后，通过计算脑区间标准化影像组学特征的皮尔逊相关性来构建R2SN。

图1. 数据分析流程示意图

2.6 R2SN 特征功能障碍与NPSs 的关系

为探究 R2SN 特征功能障碍与 NPSs 的关系，此研究对 AD-NPS 与 AD-nNPS 患者进行了双侧双样本t检验比较。两组间显示显著差异（p < 0.01）的连接被认为与 NPSs 密切相关。此外，此研究采用了一种名为非负矩阵分解的聚类方法，基于AD-NPS 患者中上述 R2SN 特征功能障碍（即AD-NPS 与 AD-nNPS 间存在显著差异的连接），对NPS 亚型进行分类。此亚型分析框架已在既往研究中广泛应用。通过分析轮廓系数值及残差平方和的变化，确定AD-NPS 患者的最佳聚类数。详细的非负矩阵分解过程及轮廓系数计算见补充材料 S05。

2.7具有特定R2SN功能障碍的不同NPS亚型之间的多组学测量差异

首先，通过与 AD-nNPS 患者进行双侧双样本t检验比较，计算出AD连续谱中每个NPS亚型的R2SN特征功能障碍。为表征不同R2SN功能障碍在 NPSs 中的独特临床表现，此研究全面探讨了每个 NPS 亚型与AD-nNPS患者在人口统计学特征、临床表现、血浆病理生物标志物、神经影像负荷、神经心理学评估及临床进展方面的差异。

为评估聚类结果的稳定性和可靠性，对AD-NPS 组患者的所有比较进行了 10,000 次完全随机置换检验。重要的是，此研究进行了内部和外部验证，以确认聚类方法的稳健性和泛化能力。详情见补充材料 S06。

2.8 AD-NPS 患者中不同 R2SN 功能障碍的生物学机制

此研究进行了基因集富集分析（GSEA），以计算每个 NPS 亚型基因表达与解剖异常之间的潜在关系。基于组水平转录组分析的基因数据集来源于艾伦人脑图谱。该资源每侧半球提供约 500 个样本，覆盖大脑、小脑和脑干，每个样本包含 62,000 个基因探针数据。使用 Abagen 工具箱将所有基因数据映射至 Brainnetome 图谱。最终，从 236 个脑区获得了 15,633 个基因。在此分析中，各 NPS 亚型与 AD-nNPS 相比的脑区灰质体积改变 t 值作为自变量，基因表达作为因变量。参照既往研究，采用偏最小二乘分析来估计与脑区灰质体积改变最相关的基因表达，并基于这些基因使用 Metascape 平台揭示每个 NPS 亚型的生物学机制。为进一步探究 AD-NPS 患者中不同 R2SN 功能障碍的特异性生物学基础，对所有 AD 连续谱受试者进行了全基因组关联分析（GWAS）。详情见补充材料 S07。

2.9各NPS亚型与AD-nNPS 组相比临床指标的纵向进展

采用包含随机截距和斜率的广义线性混合效应模型，以识别随访期间各NPS 亚型与AD连续谱患者神经心理学评估后续变化之间的纵向关联。使用普通最小二乘回归来确定每位患者随访时间与神经心理学评估之间的关联。年龄、性别、受教育程度及 APOE ε4状态被视为混杂因素。

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3.结果

3.1所有受试者基线人口统计学与临床特征

所有受试者的基线临床及生物标志物特征见表 1。与 NC 受试者相比，AD 连续谱患者通常年龄更大，女性比例更低，受教育程度更低，且更可能为 APOE ε4 携带者，并有高血压和脑血管病史（均 p < 0.05）。然而，在 AD-NPS 组与 AD-nNPS 组患者之间，上述情况以及血浆病理生物标志物均未观察到显著差异（均 p > 0.05）。AD-NPS 组患者在神经心理学评估方面比 AD-nNPS 组患者表现出更严重的损害（均 p < 0.05）。AD-NPS 组的神经精神量表评分为 8.00（中位数 = 4.00，四分位距 = 15.00）。

3.2 NC、AD-nNPS 与 AD-NPS 组间 R2SN 特征显示显著差异

NC、AD-nNPS 及 AD-NPS 组间存在大量 R2SN 连接具有显著差异（图 S1）。AD-NPS组中改变的 R2SN 连接主要位于精神行为相关脑区，包括中央前回、丘脑、额上回和扣带回（图 2A）。然而，AD-nNPS 组中改变的 R2SN 连接主要位于认知相关脑区：海马、顶上小叶和楔前叶（图 2B）。此外，300 个关键连接与NPSs 高度相关，且两组间差异显著（p < 0.01），例如涉及丘脑、背外侧壳核、额上回、颞下回及岛叶的连接（图 2C）。

3.3数据驱动方法表征 AD-NPS 中不同的 R2SN 功能障碍

与 AD-nNPS 组的比较分析揭示了具有 3 种不同 NPS 亚型的 AD 患者R2SN 存在复杂改变。具体而言，第一种 NPS 亚型（n = 187）在内侧枕叶皮层、颞下回、梭状回及丘脑表现出显著改变（图 2D），而第二种 NPS 亚型（n = 102）与 AD-nNPS 组相比差异极小（图 2E）。相反，第三种 NPS 亚型（n = 87）显示出与第一种亚型相反的改变模式（图 2F）。与第二种亚型相比，其他两种亚型在旁中央小叶、岛叶、中央后回及顶叶的形态学连接中表现出显著改变（图 2G-2I）。此外，此研究使用 AD-NPS 与 AD-nNPS 组间差异最显著的前 100 个和前 200 个特征进行了聚类分析。结果，NPS 亚型在不同连接间表现出高度一致性（重叠率分别为 84.1% 和 88.6%）。详细结果见表 S1 和 S2。

3.4聚类结果在不同数据集和脑图谱间大致可重复

在内部验证中，平均相关系数始终超过 0.4，其中 82.9% 超过 0.7。此外，在 92.2% 的案例中，每次重采样的最大相关系数超过 0.7，而 69.3% 的案例中最小相关系数超过 0.7，表明聚类方法具有良好的稳定性（图S2A-C）。

验证数据集中的患者 MMSE 和 MoCA 评分低于原始数据集中的患者，而日常生活活动能力量表和照护者负担量表评分则更高（均 p < 0.05）（表 S3）。在原始数据集与验证数据集之间，第一种 NPS 亚型（R = 0.70，p < 0.001）和第二种亚型（R = 0.58，p < 0.001）的聚类中心显示出高度一致性。然而，第三种 NPS 亚型的聚类中心在两组数据集间的一致性显著但较弱（R = 0.18，p = 0.002）（图 S2D-F）。

同时，基于不同图谱的 R2SN 模型之间，第一种（75%）和第二种（61%）NPS 亚型表现出高度一致性，而最后一种 NPS 亚型的数据点被聚类至第一种和第二种 NPS 类别中（表 S4）。总体而言，前两种 NPS 亚型在不同数据集和图谱间表现出高稳健性，而最后一种 NPS 亚型一致性较弱，反映其作为第一种和第二种亚型之间的过渡阶段。因此，部分数据点被归类至第一种和第二种 NPS 组别中（表 S5）。

表1. 基线期所有受试者的人口统计学特征、临床特征及生物标志物特征

3.5不同 R2SN 功能障碍与不同临床表型相关

表 S6 显示了各 NPS 亚型与AD-nNPS 组之间的临床及生物标志物差异。与 AD-nNPS 组相比，第一种和最后一种亚型在神经心理学评估中表现出严重损害（均 p < 0.05）。相反，第二种 NPS 亚型与 AD-nNPS 组在 MMSE 或MoCA 评分上未发现显著差异（均 p > 0.05）。同样，与 AD-nNPS 组患者相比，第一种和最后一种亚型的患者血浆 p-tau181 水平显著升高，而第二种亚型患者在该血浆生物标志物上未见显著差异。

三种 NPS 亚型在 12 项神经精神特征方面的差异详见图 S3。与其他两种亚型相比，第一种 NPS 亚型患者表现出更高的激越和易激惹发生频率（均 p < 0.05）。

由于三种亚型表现出不同的 R2SN 功能障碍、不同的临床表型及已验证的结果，此研究将其定义为重度 NPS（sNPS）、轻度 NPS（miNPS）和中度 NPS（moNPS）。经过 10,000 次置换后，三种 NPS 亚型间的所有比较置换检验 p 值均 < 0.05。

3.6不同 R2SN 功能障碍与多模态神经影像负荷相关

与 AD-nNPS 组相比，sNPS 和moNPS 亚型均在颞叶、海马、伏隔核及丘脑表现出脑区灰质体积减少（图 3A, C），并在额叶、颞叶及顶叶出现广泛的脑区皮层厚度减少（图 3D, F）。相反，miNPS 患者与 AD-nNPS 患者在脑区灰质体积（图 3B）或皮层厚度方面未观察到显著差异（图 3E）。尽管未发现显著的脑结构改变，miNPS 患者在额下回、壳核及前扣带皮层的 cCBF 值高于 AD-nNPS 患者（图 3H），提示存在早期代偿性脑高灌注。三种 NPS 亚型多模态神经影像负荷的比较分析见图 S4。

图2 R2SN图谱中形态学连接性改变的特征

3.7基于转录组和 GWAS 的三种不同NPS 亚型解剖变异的神经生物学机制

三种 NPS 亚型与 AD-nNPS 组相比的脑区灰质体积T 值图被用作每个亚型解剖变异的神经影像指标。在第一个偏最小二乘成分与三种亚型的解剖变异之间观察到显著相关性（图 4A-C）。基于转录组的 GSEA 揭示，所有三种亚型均存在离子跨膜转运和突触信号传导功能障碍，但其类型存在显著差异。sNPS 患者（图 4D）在延迟整流钾通道活性(p_FDR = 8.128 ×10^-9)、电压门控钠通道活性(pFDR = 2.884×10^-4、儿茶酚胺分泌调节(pFDR = 7.244×10^-4 ),及多巴胺能突触通路(pFDR = 2.691×10^-6 )方面显示出显著富集。相反，moNPS 患者（图4F）在胞浆钙离子浓度、钙离子结合、配体门控单原子阴离子通道活性、单原子离子通道复合物以及谷氨酸能和 GABA（γ-氨基丁酸）能突触方面表现出富集。值得注意的是，miNPS 患者未表现出显著的神经递质变化，仅在生物过程相关的基因本体论术语中观察到富集（图 4E）。

经过质量控制和数据填补后，GWAS 纳入了 997,369 个单核苷酸多态性。此研究鉴定出 2 个与 sNPS 显著相关的基因组风险位点，这些脑区中排名靠前的单核苷酸多态性映射到 13 个基因。这些基因富集在与 MCI 逻辑记忆相关的通路中，与临床表现和进展模式一致（图 5A）。此外，此研究鉴定出 5 个与miNPS 显著相关的基因组风险位点，这些脑区中排名靠前的单核苷酸多态性映射到 38 个基因，富集于 2 型糖尿病通路中（图 5B）。此外，此研究发现了 5 个与 moNPS 显著相关的基因组风险位点，富集于抗抑郁药物无应答及抑郁相关通路（图 5C）。

图3. 3种神经精神综合征（NPS）亚型与阿尔茨海默病连续谱中阿尔茨海默病神经精神综合征（AD-nNPS）患者在多模态神经影像学负荷方面的差异

3.8三种 NPS 亚型的纵向临床进展

在基线 487 名 AD 连续谱患者中，165名（34.52%）完成了随访（60 名 sNPS，49 名 miNPS，27 名 moNPS），平均随访时长为10.56 个月。基线时三种 NPS 亚型与临床进展的纵向关联见图 S5。比较分析显示，基线为 sNPS 和 moNPS 的患者在随访期间校正后 MMSE 和 MoCA 评分均显著下降（均 p < 0.05）。然而，在 miNPS 患者与 AD-nNPS 患者之间，MMSE 和 MoCA 评分的纵向变化未观察到显著差异（分别为 p = 0.173 和 p = 0.143）。

4.讨论

在此研究中，采用数据驱动方法系统地识别并验证了 AD 连续谱中三种不同的 NPSs 亚型，这有助于解决临床测量的主观性和异质性问题。此研究探索了伴 NPSs 个体的脑连接组差异，并深入理解了它们在 AD 连续谱中对脑连接性、认知进展、神经影像及基因表达的影响。这些发现可能促进针对 AD 连续谱中伴NPSs 患者的个体化治疗方法的开发。

此研究识别出具有不同脑连接损伤模式的三种NPS 亚型，为 NPS 管理和 AD 患者的精准干预迈出了一步。异质性网络模式提供了关于神经信号传导的关键信息。一项既往研究通过应用 R2SN 识别出两种不同的 MCI 亚型，从而为这些患者的风险评估和精准早期干预提供了新见解。这表明脑连接分析（如 R2SN）可以识别复杂疾病的共性和特性机制。此研究发现，sNPS 和 moNPS 患者在 AD 连续谱中具有更严重的认知损害和快速恶化，而 miNPS 患者未显示显著差异。这表明不同的 R2SN 功能障碍与不同的认知表现和结局相关。因此，R2SN 可被视为连接 NPSs 与AD 神经病理学及预后的桥梁。

图4

伴 NPSs 的个体其认知功能变化的轨迹并不一致；此外，一项既往研究表明，在整个 AD 连续谱中，NPSs 与血浆病理生物标志物之间未观察到显著相关性，这给临床治疗和管理带来了困难。然而，另一项大型队列研究发现，伴与不伴 NPSs 的 AD 患者表现出相似的认知表现，且 NPS 严重程度与诊断无关。此研究识别出三种不同的 NPS 亚型，并强调了不同 NPS 亚型与血浆 p-tau181 水平、认知损害及进展之间的潜在关联。更重要的是，GWAS 的功能富集分析显示，sNPS 亚型相关变异主要富集于逻辑记忆，与此研究的临床发现一致。因此，此研究有助于将高度异质性的 NPSs 划分为 AD 连续谱中与认知相关的三种不同亚型，从而有助于加强疾病风险分层，并为伴 NPSs 患者开发潜在的精准医疗方法。

图5. 阿尔茨海默病患者中特定神经退行性病变（NPS）亚型的 GWAS 。

关于多模态神经影像，此研究发现 sNPS 患者在颞叶表现出灰质体积下降，而 moNPS 患者在额叶表现出灰质体积下降，这与脑连接损伤的相反模式一致。与此研究发现一致，一项观察性研究识别出灰质结构与 NPSs 之间的两种典型模式：第一种模式反映了邻近颞区体积较小，而第二种模式则反映了与NC 相比，外侧和眶部前额叶脑区体积较小。此研究发现 miNPS 患者与 AD-nNPS 组在脑结构测量上无显著差异，但在额下回、壳核及前扣带皮层显示出更高的脑灌注，表明存在早期代偿性脑高灌注。这些功能变化也与该亚型较轻的临床认知损害及进展一致。

目前已识别出超过 40 个 AD 的遗传风险位点；然而，AD连续谱中 NPSs 的因果变异、调控元件、基因及通路仍基本未知。三种 NPS 亚型之间的差异在多大程度上由遗传驱动仍需进一步探索。与既往证据一致，此研究基于GWAS 的 GSEA 及转录组分析表明，无机离子跨膜转运（钠和钾）及突触信号传导（儿茶酚胺和多巴胺）与 sNPS 相关，而钙和阴离子跨膜转运及突触信号传导（谷氨酸和 GABA）与 moNPS 相关，提示这两种亚型具有不同的神经生物学机制。一项基因分析研究发现，16 个富集于离子跨膜转运的共表达基因模块与 AD 发展中的病理标志（神经原纤维缠结）及认知相关。另一项研究发现，星形胶质细胞钙信号减弱伴随脑网络活动和功能连接中断，导致早期 AD 出现 NPSs。AD 对离子通道突变的致病依赖性尚不清楚，但已有假设认为不同离子通道分布于不同轴突亚域，通过动作电位起始、传导和突触传递来调节神经网络活动。越来越多的证据表明，脑神经递质缺陷和功能障碍可调节广泛的神经精神疾病。一项近期研究发现，钾通过脂质体中的果蝇多巴胺转运体增加多巴胺摄取，并使用荧光离子指示剂观察了单个蛋白脂质体中的钠和钾离子流，与此研究对 sNPS 的发现一致。然而，一项近期雄性 C57BL/6 小鼠研究表明，极后区钙敏感受体激活抑制了急性摄食，且 R568（一种钙敏感受体激动剂）增加了极后区谷氨酸和 GABA 含量，提示钙受体与 GABA 之间存在联系，与此研究 moNPS 的发现相似。在一定程度上，此研究在分子和细胞水平解释了三种 NPS 亚型与疾病预后之间的差异和联系。这可能有助于加深对临床-影像学及 R2SN 特征之间差异的理解，并开发个体化的 NPS 治疗方法。

尽管有这些贡献，此研究存在若干局限性。首先，GSEA结果是初步的，因为它们在很大程度上依赖于仅来自艾伦脑数据集中 6 名健康受试者的基因数据。此外，由于研究样本量有限，GWAS 分析结果也受限。其次，由于脑脊液检测和正电子发射断层扫描的费用及侵入性，此研究中并非所有 AD 连续谱患者均依据 ATN 框架诊断。未来研究应纳入更全面的独立数据集以检验此研究发现结果的稳健性。由于在基于图谱定义变量跨受试者分析时，在个体空间中进行操作通常被认为是最佳程序，未来应考虑基于个体空间的 R2SN。

5.结论