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1. 引言

重性抑郁障碍（MDD）是一种致残性精神疾病，预计到2030年将成为主要疾病负担，目前是导致伤残生存年数（YLD）增长的首要原因。约半数抑郁患者无法完全康复，且治疗后常常复发。慢性应激常诱发抑郁。然而，暴露于慢性应激后，个体对抑郁的易感性存在显著差异。识别这种对应激易感性及韧性差异的机制，对于理解抑郁的病理生理学至关重要。相关啮齿类模型分析揭示了与慢性应激韧性和易感性相关的特定转录组特征。重要的是，与韧性相关的特征与易感动物及对照动物均不同。这些发现强化了"面对应激时韧性和易感性是不同的神经过程"这一观点。然而，对每种状态背后神经回路的全面理解仍不完整。

慢性社会挫败应激（CSDS）模型是经过高度验证且广泛使用的啮齿类模型，用于研究应激诱导的抑郁和焦虑行为的机制。CSDS模型也揭示了易感性及韧性的个体差异。这种个体差异在多种结局指标中均明显，包括抑郁和焦虑样行为、代谢稳态、神经内分泌及免疫信号。因此，CSDS已成为研究应激诱导抑郁病理生理学相关的表观遗传、转录及解剖机制的重要模型。对转录组特征的详细分析显示，死后人脑中与MDD相关的基因网络与暴露于CSDS的小鼠之间存在高度显著的重叠，证实了该模型对于研究MDD生物学基础的相关性。

抑郁是一种涉及多个相互连接脑区的全回路水平障碍。海马是一个异质性脑结构，其背侧和腹侧部分执行不同功能，包括与心境障碍相关的功能。啮齿类背侧海马参与空间学习/记忆，而腹侧海马对情绪加工至关重要。暴露于CSDS后活动模式的回路水平分析显示汇聚于腹侧海马。对暴露于CSDS小鼠的神经影像显示，海马与伏隔核之间的结构协变与CSDS效应的易感性显著相关，支持脑奖赏通路参与CSDS易感性。后续分析确定，从腹侧海马齿状回（vDG）到伏隔核的投射是定义CSDS易感性的神经回路。Anacker等人展示了vDG活动如何直接介导应激易感性的个体差异：激活该脑区产生易感性，而通过增强神经发生沉默vDG兴奋性则在CSDS后产生韧性。从腹侧海马传入纤维到伏隔核的谷氨酸能张力增强可增加CSDS易感性。这些汇聚性发现确定vDG是慢性社会应激易感性的关键脑区。

相比之下，对慢性应激的韧性与有效情绪调节的脑区相关。前扣带回区是一个中枢脑区，整合来自前额叶皮层的决策和认知加工信息，以及通过多个边缘脑区加工的情绪性和情绪学习相关信息。因此，前扣带回区对边缘系统内情绪活动的"自上而下"调节至关重要。识别慢性应激暴露后这些脑区间连接性的个体差异，是确定应激易感性及韧性神经生物学基础的有效方法。

此研究使用静息态功能磁共振成像（rs-fMRI）和功能连接（FC）分析，研究CSDS后易感（SUS）和韧性（RES）小鼠相较于对照非应激小鼠的脑网络变化。rs-FC测量是研究小鼠全脑网络连接性的成熟方法。既往rs-fMRI研究报告了社会心理应激反应中网络通讯的差异及个体变异性。此研究使用数据驱动的空间独立成分分析（ICA）进行的初步分析显示，所有小鼠组共有的应激相关脑区静息态脑活动，包括：vDG、基底外侧杏仁核、伏隔核和前扣带回区。此外，种子点-种子点FC分析确定vDG（上部）为显示最多FC组间差异的脑区，证实了该脑区作为介导CSDS易感性及韧性的枢纽作用。因此，vDG（上部）被用作源种子点进行种子点-全脑体素FC分析。总体而言，易感（SUS）小鼠表现出vDG与其他应激相关边缘脑区之间的过度连接相比之下，韧性（RES）小鼠显示vDG与前额叶脑区（包括前扣带回区）之间的FC增强；提示RES小鼠中vDG及可能其他边缘结构存在更大的自上而下皮层调节可能性。这些发现提示SUS和RES小鼠之间皮质-边缘连接性的重要个体差异，作为抵抗应激诱导精神病理发展的神经生物学基础。

2. 方法

2.1 动物

C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories（加拿大魁北克省圣康斯坦），并在Douglas研究中心（加拿大魁北克省蒙特利尔）饲养。饲养环境为温度（21±1°C）和湿度（55±10%）控制的房间，采用12小时光照：12小时黑暗的光周期（光照时间08:00开始）。所有程序均按照加拿大动物护理委员会指南执行，并经麦吉尔大学及Douglas研究中心设施动物护理委员会（FACC）批准的动物使用方案（AUP #7239）。雄性小鼠在出生后第22天（PND22）断奶，同窝仔鼠被分配至标准饲养条件，自由获取小鼠饲料和水，饲养8周。动物以每笼3只（来自不同窝）的方式饲养于30×18cm笼中，配备标准垫料、两个巢片及Enviro-dri作为筑巢材料。CD1退役种鼠购自Charles River Laboratories（加拿大魁北克省圣康斯坦）。

2.2 慢性社会挫败应激（CSDS）

CSDS程序遵循既往描述的类似方法，并进行了一些微小调整。在出生后第80天（PND 80），成年雄性小鼠连续10天被新的、预先筛选的CD1攻击鼠击败，每次5分钟。如果攻击持续超过10秒，小鼠被短暂分开。如果C57BL/6J小鼠受伤，当天的挫败程序终止。挫败期间的攻击次数限制为第1-3天15次，第4-5天12次，第6-10天10次。挫败程序后，C57BL/6小鼠与攻击鼠通过穿孔有机玻璃隔板在同一笼中饲养24小时。为模拟这些条件，对照小鼠每天与一只新的C57BL/6小鼠通过隔板同笼饲养，持续10天。第11天，动物进行社会交互（SI）测试筛选。第一次试验中，小鼠被允许在开放场箱（42cm×42cm×42cm）中探索，箱内有一个空的金属网围栏，探索时间2.5分钟。第二次试验中，将一只CD1小鼠放入围栏内，实验小鼠重新引入，时间2.5分钟。SI比值计算为第二次试验中在交互区停留时间除以第一次试验中在交互区停留时间。通常，SI比值<1的小鼠被分配为"易感"；SI比值>1的被分配为"韧性"。纳入rs-fMRI的挫败小鼠满足既往使用的更严格的纳入标准：SI比值>1.2或<0.8分别确定RES和SUS实验组。值得注意的是，所有可用的RES小鼠均被成像。SI比值>1.0的对照（CON）小鼠被纳入成像。最终研究群体包括N=44只小鼠；CON组n=18，SUS组n=20，RES组n=6，除RES小鼠组外，这与临床前rs-fMRI研究中传统使用的中位数n≈15一致。动物与同组伙伴配对饲养于标准笼中直至进行脑成像扫描。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估组SI分数的正态性，并相应使用四分位距法（非参数数据）或组均值±2个标准差（参数数据）进行异常值分析。

2.3 静息态功能磁共振成像分析（rs-fMRI）

2.3.1麻醉及生理维持

为与既往CSDS研究及CSDS程序的持久行为效应保持一致，rs-fMRI采集由分组盲法的实验者在SI测试后约一周完成（在3天内随机分配，即SI测试后6-8天）。小鼠首先称重（27.98g±0.29SEM），然后使用异氟烷（ISO）快速麻醉（诱导：5% ISO；维持：2% ISO体积混合100%氧气），共5分钟。随后将小鼠转移至扫描仪及低温探头床组件，同时应用1.0-1.5% ISO麻醉，混合20/80氧气/医用空气。rs-fMRI扫描sessions期间ISO麻醉平均维持在1.29%±0.04SEM。使用37°C的温热气流维持动物体温。使用1025-IBP-50小动物监测门控系统监测呼吸频率；平均为91.2±1.5（次/分钟±SEM）。使用脉搏血氧传感器夹固定于右后肢实时监测血氧饱和度。

2.3.2 rs-fMRI采集

数据使用配备低温探头的7T小动物扫描仪（BioSpec 70/30 USR，Bruker）采集。所有fMRI图像采用自旋回波EPI脉冲序列获取，参数如下：视野（FOV）：3.5×1；矩阵：128×80；层数：15；分辨率：139×125×700μm³；TE/TR：1/1.50s；翻转角90；重复次数：400。

2.3.3 rs-fMRI预处理

预处理包括：(i) 使用Advanced Normalized Tools（ANTs）去噪；(ii) 使用ANTs和FSL工具进行运动校正；(iii)使用ANTs和MINC工具进行共配准，首先从所有被试的平均图像创建功能模板，然后将每个被试的功能数据归一化到该模板；(iv) 使用ANTs进行偏置场校正；(v)使用MINC工具的register程序，通过仿射变换和手动"标记"步骤iv中被试fMRI图像与Allen小鼠脑高分辨率模板上对应点完成配准，该模板按既往描述进行重采样以获得最佳拟合——实现各向同性全脑体素分辨率150×150×150μm³，以进一步分析和参照Allen小鼠脑图谱（AMBA）；(vi)使用功能神经影像分析（AFNI）工具，通过回归脑脊液掩模信号进行脑室信号回归；(vii) 使用AFNI工具进行平滑处理，高斯核半高全宽（FWHM）为0.6；(viii) 使用根据AMBA模板空间灰白质分割生成的脑掩模进行裁剪，并应用于所有被试；(ix) 使用AFNI进行0.01Hz至0.1Hz的带通滤波。

2.3.4后处理

此研究应用三种方法研究rs-FC：(i) 低成分空间独立成分分析（ICA-20），(ii) 种子点-种子点功能连接分析，(iii) 种子点-全脑体素功能连接分析。所有统计检验均基于对研究数据的正态性、组内方差和方差齐性假设进行。

2.3.5独立成分分析（ICA）

使用GIFT工具（fMRI组独立成分分析工具箱，v1.3i）在MATLAB中分别对SUS、RES和CON小鼠组进行数据驱动的ICA，以确定可识别的成分是否与CSDS模型既往识别的应激相关脑区匹配，以及这些成分是否在所有小鼠组中一致。ICA输出限制为20个成分，以研究较大的脑网络和脑区活动，同时考虑应激相关解剖结构及小鼠脑rs-fMRI数据的适当分解。使用ICASSO通过随机化和自助法检验成分的稳定性和可靠性。基于ICA的结果确定后续种子点-种子点功能连接分析的种子点。

2.3.6种子点-种子点功能连接分析

基于ICA的结果及既往研究确定的应激相关脑区的先验感兴趣区，进行种子点-种子点功能连接分析。双侧种子点定义了14个感兴趣脑区，包括：vDG——上部和下部、内侧前额叶皮层亚区（包括前扣带、前边缘和下边缘皮层）、伏隔核壳部、终纹床核、缰核、基底外侧和中央杏仁核、腹侧被盖区、中脑导水管周围灰质、中缝背核及蓝斑。现有AMBA模板标签的种子点掩模缺乏足够的脑区内特异性，需要使用MINC工具Display结合高分辨率AMBA进行显著的全脑体素-全脑体素分割。相关分析使用MATLAB完成。在被试水平，从每个种子点脑区提取平均时间序列，并计算种子点对的Pearson相关系数（r）。组内种子点对的统计显著性使用内部开发的简单MATLAB脚本，采用单样本学生T检验确定；阈值T>2；p<0.05；FDR校正。组间种子点对差异使用双样本学生T检验确定；阈值T>2；p<0.05；FDR校正。

2.3.7种子点-全脑体素分析

进行种子点-全脑体素分析以研究vDG（上部）种子点的全脑FC模式。使用FSL工具，将vDG（上部）种子点的平均时间序列与每个被试的全脑活动（全脑体素水平）进行相关分析；进行Fisher Z变换，使用双样本学生t检验进行组间比较分析（阈值T>2；p=0.05）。结果经团块水平上，使用p=0.05的阈值，进行(家族错误率)FWER校正。使用Mango工具进行vDG（上部）种子点的3D呈现，并构建叠加在AMBA模板图像上的3D相关图。使用内部开发的MATLAB脚本对选定脑区的种子点-全脑体素功能连接结果进行后续定量分析。使用BrainNet Viewer工具进行叠加在AMBA图像上的发现的三维呈现。箱线图代表被试水平相关系数（CC），展示vDG（上部）种子点与单个（峰值）全脑体素（最高t统计值）或特定脑区内共同全脑体素（即ACA）之间的FC组间差异。使用R软件包进行。

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3.结果

研究设计如图1所示，包括 CSDS 模型、MRI数据采集与处理流程。

图1实验设计、rs-fMRI数据采集与处理。

3.1 社会交互偏好

根据SI比值表征的动物显示，被击败的SUS和RES小鼠组存在明显的聚类（图2A左）。Kruskal-Wallis检验显示显著的组效应（H(2)=32.54，p<0.0001），Dunn's两两检验表明SUS小鼠的SI比值显著低于CON和RES小鼠组（p<0.0001）（图2A左）。纳入一个CON小鼠异常值的数据对后续FC分析无影响。此外，Kruskal-Wallis检验显示显著的组效应（H(2)=28.86，p<0.001），Dunn's两两检验显示，当CD1攻击鼠在场时，SUS小鼠在SI区停留时间显著少于CON（p<0.0001）和RES（p<0.05）小鼠组。

3.2 rs-fMRI数据的空间独立成分分析

分别在SUS、RES和CON组小鼠中进行的低成分空间ICA显示，所有小鼠组之间存在一致的静息态脑活动，可识别的成分与CSDS模型既往识别的应激相关脑区匹配（图2B）。完整发现亦包括在内。在大多数情况下，这些脑区显示双侧激活，包括：vDG、基底外侧杏仁核、伏隔核和前扣带回区（图2B）。值得注意的是，此研究在ICA结果中未发现组间一致的证据。

图2 CON、SUS及RES小鼠组的社会互动偏好及选定的独立成分分析（ICA）结果。

3.3 应激相关脑区间的种子点-种子点功能连接分析

考虑ICA结果及既往CSDS研究中涉及的应激相关脑区，此研究选择14个脑区进行种子点-种子点FC分析。双侧/中央种子点包括前扣带回区、前边缘和下边缘前额叶皮层、伏隔核壳部、终纹床核、缰核、基底外侧和中央杏仁核、vDG（上部）和vDG（下部）脑区、腹侧被盖区、中脑导水管周围灰质、中缝背核和蓝斑脑区，以AMBA模板空间三维呈现（图3A）。从rs-fMRI数据中提取每个种子点脑区的被试水平时间序列，并与所有其他种子点相关，计算组平均相关系数（图3B）。使用单样本学生t检验（p<0.05，FDR 阈值 0.05）评估显著的组内种子点-种子点连接（图3C）。使用双样本学生t检验（p<0.05，−2>t>2，FDR 阈值0.05）识别显著的种子点对组间差异（图3D）。

与CON小鼠相比，SUS小鼠（而非RES小鼠）显示vDG与中脑导水管周围灰质以及伏隔核壳部之间的FC显著增强（图3D上、中）。与RES小鼠相比，SUS小鼠还显示vDG与腹侧被盖区以及基底外侧杏仁核之间的FC显著增强（图3D下）。此外，与RES小鼠相比，SUS小鼠腹侧被盖区与下边缘和前边缘前额叶皮层之间的FC更强（图3D下）。与SUS小鼠不同，RES小鼠主要显示负相关（图3B下），且应激敏感皮质下脑区之间的FC降低。因此，SUS小鼠脑以vDG与应激相关边缘脑区之间的过度连接（hyperconnectivity）为最佳特征。值得注意的是，与CON小鼠相比，SUS和RES动物均显示vDG与前扣带回区之间的连接降低（图3D上、中）。然而，与SUS小鼠相比，RES小鼠显示vDG与前扣带回区之间的FC显著增强（图3D下）。有趣的是，与CON小鼠相比，RES小鼠显示伏隔核壳部与下边缘前额叶皮层之间的FC显著增强（图3D中）。因此，与SUS小鼠脑相比，RES小鼠脑以皮质下（vDG或伏隔核壳部）与皮质脑区（包括前扣带和下边缘皮层）之间的功能过度连接（functional hyperconnectivity）为最佳特征。值得注意的是，使用选定单侧种子点的种子点-种子点分析发现与使用双侧种子点的发现基本一致（补充图S3）。由于vDG（上部）脑区在选定脑区中显示最多显著的FC组间差异，后续FC分析聚焦于vDG（上部）种子点。

图3 14个应激相关脑区之间的种子点-种子点功能连接（FC）。

3.4 vDG种子点-全脑体素功能连接分析

此研究在全脑体素水平回顾了vDG（上部）种子点的全脑FC（图4A）。vDG种子点-全脑体素FC的组间差异识别了特定于各小鼠组的优先连接模式（图4B-D）。此研究再次发现SUS小鼠脑中应激相关皮质下脑区之间过度连接（hyperconnectivity）的证据，显示了分析方法间的汇聚。与CON小鼠相比，SUS小鼠显示vDG种子点与伏隔核脑区之间的FC显著增强（图4B）。与RES小鼠相比，SUS小鼠还显示vDG种子点与基底外侧杏仁核、下丘脑、腹侧被盖区和中脑导水管周围灰质脑区之间的FC显著增强（图4D）。

此研究还发现vDG种子点与皮质脑区之间的FC组间差异。重要的是，与SUS小鼠相比，RES小鼠再次显示vDG种子点与前扣带以及前边缘前额叶脑区之间的FC显著更强（图4D）。总体而言，种子点-全脑体素功能连接发现支持种子点-种子点功能连接分析结果结论，并进一步证明RES小鼠脑以vDG与皮质脑区之间的功能过度连接（functional hyperconnectivity）为最佳特征。

图4全脑vDG（顶部）种子点到全脑体素功能连接分析。

3.5 vDG种子点与前扣带回峰值体素之间的功能连接对比

上述vDG种子点-全脑体素功能连接组间对比的一个共同发现是vDG与前扣带回区之间FC存在显著差异。为进一步检验这些差异，此研究评估了vDG种子点与各组对比中前扣带团块内峰值全脑体素（即最高t值）之间的连接。此研究发现峰值前扣带回区全脑体素的位置和幅度取决于特定的组间对比（图5A-C上图）。SUS与RES组对比的峰值前扣带回区全脑体素定位于该脑区内更靠后的位置，SUS小鼠显示vDG连接显著降低（图5C上）。与SUS小鼠相比，RES小鼠显示vDG与前扣带回区峰值全脑体素之间的FC显著增强（t(24)=4.14，p=0.0003，FDR截断0.05）（图5C下）。这些结果进一步支持vDG与前扣带回区之间的功能过度连接（functional hyperconnectivity）作为慢性应激后恢复韧性的可能生物学机制。

图5 vDG与ACA峰值体素连接性的组间对比。

3.6 选定脑区vDG种子点-全脑体素分析的定量分析

随后，此研究确定vDG（上部）种子点与五个目标脑区之间连接聚类的幅度；包括前扣带回区、伏隔核、基底外侧杏仁核、腹侧被盖区和中脑导水管周围灰质（图6A）。从组间对比t统计图中，此研究量化显示了与vDG种子点显著FC差异的脑区特异性连接团块中的全脑体素数量和百分比（相对于总种子点脑区大小）。FC的幅度由vDG与其他脑区之间的线厚度/色条表示（图6B-D）。与CON小鼠相比，SUS小鼠中vDG与伏隔核以及中脑导水管周围灰质脑区之间的FC幅度显著且最稳健（图6B）。与RES小鼠相比，SUS小鼠vDG与多个边缘结构（包括基底外侧杏仁核、腹侧被盖区和中脑导水管周围灰质）之间的FC差异幅度也显著更高（图6D），支持既往发现，即SUS小鼠脑中vDG与其他边缘脑区的过度连接。定量分析进一步显示，与SUS小鼠相比，RES小鼠vDG与前扣带回区之间的FC幅度显著增强（图6D）。这些分析支持既往种子点-种子点功能连接分析结果和种子点-全脑体素功能连接分析结果，并突出显示暴露于应激后韧性可能出现的潜在重要生物学机制。

图6 vDG（上）种子体素功能连接与选定脑区的量化分析。

4. 讨论

CSDS是一个经过充分验证的模型系统，用于研究应激反应性个体差异的分子机制，对心境障碍的病理生理学具有潜在意义。该模型的相关性，特别是对于韧性相较于易感动物的研究，基于以下发现：1）应激可诱发部分人群的MDD；2）应激反应性的个体差异调节应激对继发MDD风险的影响。因此，模型系统的分子分析聚焦于已知对激活慢性应激行为反应重要的脑区。CSDS模型的一个特殊优势是清晰识别区分RES和SUS动物的分子通路。

4.1 结论

此研究使用成熟的啮齿类模型，在定义为易感和韧性的动物之间发现了不同的FC模式。SUS动物腹侧海马与应激激活相关的边缘脑区之间的增强连接，与现有慢性应激文献一致。此处一个高度新颖的发现是，腹侧海马与前额叶皮层的过度连接（hyperconnectivity）作为RES动物的一致特征。因此，临床相关动物模型的神经影像分析允许识别慢性应激反应个体差异背后的新通路。神经影像方法的一个优势是其在啮齿类和人类之间在操作和分析上具有可比性，从而为研究精神疾病的神经基础提供了转化价值。