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1.引言

遗传性痉挛性截瘫（HSP）指一组异质性神经退行性疾病，以下肢进行性痉挛和无力为主要特征。由于广泛的遗传和表型变异性，HSP可根据是否合并额外临床体征和症状分为单纯型和复杂型，合并症状包括癫痫、共济失调、锥体外系特征、认知损害、周围神经病变及自主神经功能障碍。在单纯型中，痉挛性截瘫4型（SPG4；亦称SPAST-HSP）最为常见，由编码spastin蛋白的SPAST基因致病性变异所致。尽管SPG4的病理生理基础被认为主要反映脊髓皮质脊髓束（CST）的结构变性，其次为背柱薄束及脊髓小脑束的变性，但日益增多的神经影像证据表明，在SPG4等HSP单纯型变体中亦存在脑结构和功能改变。此外，神经病理学研究一致证实SPG4患者初级运动皮层第V层Betz细胞丢失。总体而言，这些发现为解释SPG4中下肢特异性受累的病理生理机制开辟了新的可能。

既往结构MRI研究报道了HSP患者灰质（GM）体积减少及广泛白质（WM）微结构异常。更具体而言，HSP神经影像研究已证实皮层厚度及皮层下结构（包括丘脑和基底节感觉运动区）体积的结构性改变。然而，既往研究的临床队列规模较小，且最重要的是，临床和遗传上具有异质性。该领域的进一步进展需要更大规模且遗传同质的单纯型HSP（如SPG4）患者队列进行更系统的神经影像研究，以探讨可能的灰质和白质结构改变。

此外，迄今为止尚无神经影像研究通过在大规模且经基因证实的SPG4患者队列中考察皮层、皮层下、小脑及脊髓体积的结构变化以及白质束（即皮质脊髓束-CST和丘脑皮层束-TCT）的完整性，来探讨导致下肢特异性受累的病理生理机制。

在此研究中，为深入探讨SPG4的病理生理基础，评估了参与运动控制的皮层初级运动区、皮层下、丘脑及小脑结构的结构特性以及脊髓完整性。

此外，使用概率性纤维束成像检查了皮质脊髓束和丘脑-皮层连接的结构特征，特别针对上肢和下肢分别考察了不同的皮质脊髓纤维束，以及连接感觉运动丘脑区与相应初级运动皮层的丘脑皮层束。最后，评估了疾病严重程度与上下肢运动通路地形相关MRI指标之间可能的临床-放射学关联。

2.方法

受试者

所有患者及健康对照均招募自意大利罗马大学人体神经科学系及罗马阿戈斯蒂诺·杰梅利大学综合医院神经内科。

此研究纳入经分子诊断的SPAST-HSP患者及年龄、性别匹配且与患者无血缘关系的健康志愿者对照组。

所有受试者排除标准如下：（i）其他神经系统、精神或系统性疾病；（ii）物质滥用；（iii）MRI禁忌症；（iv）MRI检查发现伴有相关局灶性或弥漫性脑损伤征象。

此研究遵循罗马大学翁贝托一世综合医院伦理委员会伦理准则（编号：5659/26.03.2020）及赫尔辛基宣言进行。经伦理委员会批准后，获得所有受试者书面知情同意。

遗传学检查

遗传学检查从患者队列采集的外周血样本中分离基因组DNA，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit-QIAGEN程序。使用靶向测序和Sanger测序检测SPAST基因点突变。采用多重连接依赖性探针扩增（MLPA）技术识别大片段的缺失和/或重复。此研究队列中发现了多种遗传变异度较高的SPAST基因变异。更具体而言，在一个包含八名旁系成员的大型家族及两名独立患者中鉴定出非经典剪接位点内含子点变异（即NM_014946.4(SPAST):c.1537-8 T > G）。此外，在一个有三名同胞的家族中鉴定出剪接供体变异（NM_014946.4(SPAST):c.1245 + 1G > A）。另外，在两名独立先证者（分别为NM_014946.4(SPAST):c.1472 A>G和NM_014946.4(SPAST):c.131 C>T）、一个有四名成员的家族（即NM_014946.4(SPAST):c.1378 C>T）及三名独立患者（即NM_014946.4(SPAST):c.1304 C>T）中分别鉴定出四种不同的错义突变。相反，在两个独立家族中报告了无义SPAST变异，分别包含两名成员（即NM_014946.4(SPAST):c.1741 C>T）和三名成员（即NM_014946.4(SPAST):c.1291 C>T）。此外，在三名独立受试者中分别收集到三种不同的SPAST重复（即NM_014946.4(SPAST):c.1340 dup；SPAST:ex5-6 dup；NM_014946.4(SPAST):c.924 dup），以及五种特定缺失，其中三种发现于独立患者（即SPAST:ex1 del、SPAST:del444G和SPAST:c.322_334 delGTGCCGGGCGGCG），一种鉴定于两名同胞及一个有五名成员的家族（即NM_014946.4(SPAST):c.1215_1219 del）。最后，在两名独立患者中揭示出两种进一步的点突变（即SPAST:c.683_2 A>G和SPAST:c.564G>T）。

临床与神经心理学评估

疾病严重程度采用神经系统检查、痉挛性截瘫评定量表（SPRS）及改良Ashworth量表（MAS）进行评估。此外，认知功能及日常生活活动能力分别采用简易精神状态检查（MMSE）和巴氏指数（BI）进行评分。

MRI数据采集

图像使用3-特斯拉（3 T）扫描仪（Siemens Magnetom Verio）及专为并行成像（GRAPPA）设计的12通道头线圈采集。采集序列如下：

l 高分辨率3DT1加权（T1-3D）磁化准备快速梯度回波（MPRAGE）序列（重复时间（TR）= 2,400 ms，回波时间（TE）= 2.12 ms，反转时间（TI）= 1000 ms，翻转角= 8°，视野（FOV）= 256 mm，矩阵= 256×256，176层矢状位层厚1-mm，无间隔）；

l 弥散张量成像（DTI）单次激发、平面回波、自旋回波序列，包含10个间隔的b = 0（b0）容积及64个梯度方向（TR = 4,600 ms，TE = 78 ms，多频带加速因子= 2，单极弥散方案，FOV = 192 mm，矩阵= 96×96，b = 1,000 s/mm²，72层连续轴位层厚2-mm）；

l 双回波快速自旋回波、质子密度（PD）和T2加权图像（TR = 3,320 ms，TE1 = 10 ms，TE2 = 103 ms，FOV = 220 mm，矩阵= 384×384，25层轴位层厚4-mm，30%间隔）；

l 高分辨率3D液体衰减反转恢复（FLAIR）序列（TR = 6,000 ms，TE = 395 ms，TI = 2100 ms，FOV = 256 mm，矩阵= 256×256，176层矢状位层厚1-mm，无间隔）。

两名资深放射科医师（PP和EG，分别拥有超过20年和10年经验）审阅所有MRI，评估T2和T2 FLAIRDTI概率性纤维追踪及网络构建（WMH）的存在，并根据四阶段Fazekas视觉评定量表（Fazekas 0–1 = 无至轻度WMH，Fazekas 2 = 中度WMH，Fazekas 3 = 重度WMH）进行视觉评分。Fazekas评分≥2的患者被视为存在相关局灶性白质损伤，因此不纳入研究，以避免广泛WMH对纤维束成像可靠性的潜在混杂影响。

MRI分析

数据预处理

解剖预处理使用fMRIPrep 23.0.2（RRID:SCR_016216）进行，该工具基于Nipype 1.8.6（RRID:SCR_002502）。弥散数据使用不同的FDT工具（FMRIB弥散工具箱，属于FSL（FMRIB软件库v.6.0.4，http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/）的一部分）进行预处理。解剖及弥散预处理描述详见补充材料。

皮层厚度与灰质体积

经集成于fMRIPrep流程中的FreeSurfer（版本7.3.2）预处理后，提取左右半球全局皮层厚度，以及从Brainnetome图谱（https://atlas.brainnetome.org/download.html）选取的初级运动皮层感兴趣区（ROIs）的平均皮层厚度：左右侧M1上肢区（"A4ul，4区"）和下肢区（"A4ll，4区"）。提取总灰质（GM）和白质（WM）体积以及上述皮层ROIs的GM体积，并使用总颅内体积（TIV）进行标准化，TIV亦直接由FreeSurfer获取。

基底节与丘脑体积测定

左右壳核、尾状核、苍白球及丘脑体积直接从FreeSurfer最终输出中提取。感觉运动丘脑核团（前腹外侧核-VLa和后腹外侧核-VLp）的体积亦采用多图谱分割技术（THOMAS-丘脑优化多图谱分割）在个体结构空间中获得。所有皮层下体积均使用TIV进行头围标准化，并用于后续统计分析。

小脑体积测定

小脑体积使用在SPM12（http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）中实现的空间无偏幕下模板工具箱（SUIT）3.4版（http://www.diedrichsenlab.org/imaging.suit.htm）进行计算。使用SUIT执行以下步骤：（1）从T1-3D解剖图像中提取每位受试者的小脑；（2）使用仿射变换矩阵和非线性流场将分离出的小脑标准化至SUIT图谱模板空间；（3）对小脑进行重切片，以保留SUIT图谱模板空间中小脑小叶的体积。最后，将获得的SUIT图谱重新对齐回受试者原生空间。对每位受试者的28个小脑小叶进行分割，获取全小脑体积、前部（小叶I-V之和）和后部（小叶VI-X之和）小脑及小脑蚓部体积的测量值，然后使用TIV进行头围标准化并用于后续统计分析。

脊髓面积

脊髓分割使用脊髓工具箱（SCT）5.4版中的deepseg算法进行。该方法首先使用支持向量机结合方向梯度直方图算法（称为"OptiC"方法）寻找脊髓（SC）中心线，随后围绕中心线裁剪并使用2D核的卷积神经网络进行分割。分割后，使用SCT的sct_label_vertebrae工具进行椎体标记。简言之，使用OptiC算法识别C2-C3椎间盘，然后通过SC拉直及随后的模板匹配（使用PAM50模板）找到其他椎间盘。椎间盘识别后，上述SC分割结果被标记相应椎体水平。数据由两名资深放射科医师（EG和CG，均拥有超过10年经验）检查并在必要时手动调整，以确保椎体标记正确。脊髓面积使用sct_process_segmentation工具计算为C2和C3椎体水平之间的平均值。

纤维束成像

为研究皮质脊髓束（上肢和下肢纤维束）及连接初级运动区与感觉运动丘脑区的纤维束的白质结构完整性，选取以下ROIs进行纤维束成像分析：左右侧M1上肢和下肢区（选自Brainnetome图谱）、大脑脚（CP）（选自ICBM-DTI-81白质标记图谱，http://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/data/atlas descriptions.html）及丘脑亚区VLa和VLp（使用THOMAS-丘脑优化多图谱分割选取）。皮层及皮层下区域使用先前生成的配准参数从标准和/或结构空间转换至弥散空间。

概率性纤维束成像在每位受试者的弥散空间内使用BedpostX以默认参数进行。从每个皮层区域（左右M1上肢和下肢）到每个皮层下目标结构（左右VLa、VLP、CP）生成流线概率分布图。每张图中，皮层区域指定为种子点，皮层下区域指定为目标区，对侧半球指定为排除掩模。皮层下目标区亦被指定为终止掩模，以定义特定种子点与目标区之间的精确排他连接。通过将概率图除以成功生成的总流线数，对路径概率图进行种子点大小标准化，并通过将所得图以5%阈值化以去除虚假连接。阈值化后的概率图随后二值化并叠加至各向异性分数（FA）图上，从中提取平均值。为分别计算上肢和下肢纤维束的平均FA值，选取从脑凸面延伸至侧脑室上部的纤维束部分（图1）。此举确保平均FA值专门从这些纤维束界定更为清晰的分段提取。

统计分析

统计分析使用SPSS统计软件（22.0版）进行。在每个研究组内进行Shapiro-Wilk正态性检验，以检查人口学、临床、神经心理学及结构MRI参数的正态分布。由于若干变量在至少一个研究组中不满足正态性假设，采用保守方法以降低I类错误（假阳性）风险，并对所有比较使用非参数检验。人口学、临床、神经心理学及结构MRI参数的组间差异分别使用Mann-Whitney U检验和卡方检验对连续变量和二分类变量进行检验（拒绝零假设标准p < 0.05）。为考虑年龄和性别的潜在混杂效应，首先使用线性回归模型计算标准化残差，随后用于组间比较。

在SPG4患者中，对显示显著组间差异的MRI指标的年龄校正残差与临床指标（病程、SPRS和MAS）进行Spearman相关分析，残差通过健康对照组线性回归获得。简言之，为区分正常衰老效应与SPG4中疾病相关改变，使用仅限于健康对照组的线性回归对每个结构MRI指标对年龄的依赖性进行建模。然后将所得回归系数应用于患者数据，以计算年龄校正残差，该残差反映了与年龄匹配健康人群中预期值的偏差。这些残差随后用于评估与临床指标的相关性。

所有结果均使用错误发现率（FDR）校正进行多重比较校正。

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3.结果

此研究纳入40名患者（13名女性，占32.5%），表现为常染色体显性遗传模式的单纯型HSP表型。

40名患者及40名健康对照的人口学及临床参数描述性统计见表1。患者与对照之间在年龄或性别分布上无显著差异。在患者组中，病程与SPRS评分（r = 0.525，FDR-p < 0.009）及MAS评分（r = 0.336，FDR-p = 0.040）呈正相关，与BI（r = -0.519，FDR-p = 0.001）及MMSE评分（r = -0.319，FDR-p = 0.047）呈负相关。

SPRS评分亦与MAS评分呈正相关（r = 0.742，FDR-p < 0.001），与BI（r = -0.706，FDR-p < 0.001）及MMSE（r = -0.398，FDR-p < 0.011）呈负相关。此外，BI与MAS评分呈负相关（r = -0.551，FDR-p < 0.001），与MMSE呈正相关（r = 0.606，FDR-p < 0.001），且MAS评分与MMSE呈负相关（r = -0.436，FDR-p = 0.008）。

皮层、皮层下及脊髓完整性

与对照相比，SPG4患者在整体丘脑体积以及VLa和VLp丘脑体积方面表现出显著减少（表2），且脊髓面积亦显著减少（表2）。相反，两组间整体及M1（上肢和下肢）皮层厚度值相当。其余皮层、基底节及小脑灰质体积指标在患者与对照间均相似（表2）。

纤维束成像

重建的白质束（CST的上肢和下肢束及TCT）见图1。Mann-Whitney检验显示，与HC相比，患者双侧CST（下肢）及TCT（VLa-下肢和VLp-下肢）束的FA值显著较低（表3；图1）。经多重比较校正后，其他重建白质束的FA值在组间未出现其他显著差异（表3）。

MRI指标与临床数据的相关性

在患者组中，SPRS评分与左右整体丘脑体积（r = -0.413，FDR-p = 0.049；r = -0.456，FDR-p = 0.030）以及MAS评分与右侧整体丘脑体积（r = -0.466，FDR-p = 0.030）之间存在显著负相关。

关于感觉运动丘脑核团，SPRS评分与左侧VLp体积之间存在显著负相关（r = -0.466，FDR-p = 0.030）。

临床评分与其他MRI衍生指标之间未发现其他经FDR校正后存活的相关性。

然而，作为探索性发现，报告SPRS评分与左侧CST（下肢）FA值（r = -0.419，p = 0.011）及左侧TCT（VLp-下肢）FA值（r = -0.377，p = 0.026）之间存在未经校正的显著负相关。尽管这些关联未通过FDR校正，但鉴于其与此研究先验假设一致，且既往证据支持SPG4中疾病严重程度与运动通路受累之间存在显著关系，故予以报告。

图1上下肢运动表征相关皮质脊髓（CST）与丘脑皮质（TCT）纤维束的可视化示意图。

表1健康对照组与SPG4患者的人口统计学及临床特征

表2健康对照组与SPG4患者的大脑皮层厚度、皮层、基底节、丘脑及小脑体积

4.讨论

在此研究中，于大规模SPG4患者队列中评估了皮层、皮层下、丘脑及小脑结构的结构完整性以及脊髓完整性。同时，通过概率性纤维束成像检查了皮质脊髓束和丘脑-皮层连接的结构完整性，重点关注与上肢和下肢地形相关的功能特异性纤维束。通过证明下肢相关运动通路中显著的灰质和白质结构改变及显著的临床-放射学关联，此研究对SPG4的病理生理基础获得了更深入的认识。

皮层、皮层下及脊髓结构完整性

在此研究中，发现SPG4患者存在双侧丘脑萎缩，尤其在感觉运动区（VLa和VLp）。VLa和VLp核团是丘脑腹外侧核（VL）的亚区，该核团是运动控制网络的重要中继站。VLa和VLp核团分别整合来自苍白球-丘脑和小脑-红核-丘脑通路的运动输入，并继而投射至运动皮层。这些结果与既往强调SPG4中存在显著丘脑退行性变的研究完全一致，从而支持其作为该疾病可能的神经影像生物标志物的作用。此研究还观察到丘脑萎缩程度与标准化临床量表评定的疾病严重程度之间存在显著相关性：丘脑体积越小，SPRS和MAS评分越高。总体而言，此证据表明运动丘脑是SPG4病理生理学中的关键结构，并提示监测丘脑萎缩可作为SPG4患者疾病进展和功能衰退的潜在标志物。

相反，整体及M1（上肢和下肢）皮层厚度以及基底节体积在患者与对照间均相当。此发现与既往在HSP患者中报道的皮层变薄部分不一致。然而，需考虑既往研究队列仅包含少数SPG4患者，这提示HSP中皮层变薄更可能发生在复杂型而非单纯型变体中。

关于小脑，此研究发现患者与对照之间灰质体积相当，与既往在SPG4及其他HSP单纯型变体中的研究一致。因此得出以下结论：尽管已知脊髓小脑束在SPG4中亦发生变性，但小脑不太可能代表SPG4病理生理学中的关键结构。

此结构分析还显示SPG4患者存在显著的脊髓受累，表现为神经影像学测量的脊髓萎缩。此发现证实并扩展了既往观察结果，提示SPG4患者脊髓面积减少是一个一致的发现，具有重要的病理生理学意义，包括未来可能作为SPG4疾病生物标志物的用途。

表3健康对照组与SPG4患者中感兴趣白质束的FA值

皮质脊髓束和丘脑-皮层通路的结构完整性

最相关的发现是CST和TCT中存在结构异常（表现为FA降低），且这些异常与下肢功能具有地形相关性和显著性。FA是一种广泛使用的DTI衍生指标，用于量化体素内各向异性弥散的程度，较高的FA值通常表明由于体素内纤维取向一致性、轴突密度和髓鞘化程度较高而具有更好的白质完整性。因此，在与下肢功能相关的纤维束中观察到的FA降低提示潜在的轴突损伤和/或脱髓鞘。此研究发现CST中FA降低与既往该领域研究完全一致，既往研究报道单纯型遗传性痉挛性截瘫患者额叶连接中该白质完整性特定参数降低。

尽管既往研究已报道HSP患者CST整体完整性显著降低，但尚无研究探讨该神经系统疾病中的TCT异常。此外，此研究是首项分别针对上肢和下肢功能探索这两种白质束微结构完整性的研究。

与此研究先验假设一致，观察到这些纤维束的微结构改变与SPG4患者疾病严重程度和运动损害的临床指标之间存在关联。尽管这些发现需要进一步验证，但提示与下肢功能相关的CST和TCT束的白质改变可能代表SPG4患者疾病进展的新的潜在生物标志物。

SPG4中灰质和白质改变：病理生理学意义

SPG4由位于染色体2p22.3的SPAST基因突变引起。该基因编码spastin，一种属于ATP酶微管切割蛋白家族的成员，该蛋白在微管动力学、轴突运输和细胞器分布中起关键作用。在SPG4中，突变的spastin蛋白破坏微管稳定性和内质网功能，导致中枢神经系统长神经元轴突运输受损和变性（即远端轴突病）。因此，当前对SPG4相关临床表现的主流病理生理学解释是"逆行性死亡"假说，该假说预测CST最长/远端轴突的逆行性变性，其次为脊髓小脑束及背柱薄束的变性。该假说确实与成年早期至中期起病、缓慢进展的下肢无力和痉挛、伴有反射亢进和巴氏征的临床表现相符。此神经影像研究中报告的总体发现与"逆行性死亡"假说高度吻合。在此研究SPG4患者队列中观察到的与下肢地形相关的选择性CST束的显著白质束变性，完全符合远端轴突病。此外，概率性纤维束成像与疾病严重程度临床指标之间的相关性进一步支持了当前对SPG4相关症状的病理生理学解释。同时，观察到一致的脊髓萎缩亦指向SPG4患者的轴突变性。最后，尽管较难解释，但此研究观察到运动丘脑（VLa和VLp）的一致萎缩以及与之地形相关的TCT下肢选择性束变性，亦因皮质脊髓束的逆行性变性而与"逆行性死亡"假说相吻合。

在批判性评估此研究神经影像发现时，应考虑若干局限性。尽管所有患者均经基因证实，但入组患者在年龄和病程方面存在较大异质性，因此难以就SPG4中灰质和白质结构改变的演变及其与运动体征的因果关系得出确切结论。此外，此研究未探讨此研究SPG4患者队列中spastin特定突变（包括新发错义和无义突变）的神经影像学基础及其与临床数据的可能相关性。再者，丘脑核团的精确分割以及与上下肢功能地形相关的白质束识别可能存在若干争议，这些争议与自动化分割方法和概率性纤维束成像的方法学局限性有关。最后，尽管此研究证明纤维束成像是检查SPG4患者CTS和TCT完整性的有用工具，但需考虑该技术无法检测到可能低于当前技术检测阈值的小纤维束或早期轴突损伤。未来的纵向研究若整合功能成像或互补的结构技术（如髓鞘敏感成像或高级弥散模型），或可进一步加强对这些通路的特征描述，并对SPG4相关神经退行性变提供更深入的见解，同时亦可探索spastin突变的特定模式。值得注意的是，纵向DTI分析可能有助于阐明微结构改变是否随时间推移与临床进展一致而演变，抑或反映代偿机制，如Montanaro等人先前所提示。

结论

在此研究中，于大规模SPG4患者队列中观察到显著的丘脑萎缩，且该萎缩与疾病严重程度相关，从而强调了丘脑萎缩作为SPG4患者疾病进展和功能衰退潜在生物标志物的相关性。此外，SPG4患者表现为脊髓面积减少以及与下肢功能地形相关的白质束（CST和TCT）选择性变性。这些观察结果代表了SPG4患者进行性痉挛和运动损害的特定病理生理基础。相比之下，大脑皮层、基底节及小脑灰质完整性的结构指标在SPG4患者与对照间均相当。未来的研究将为开发创新的脑和脊髓结构分析方法铺平道路，以进一步改善临床实践中SPG4患者的诊断和监测。