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1.背景  

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种破坏性的神经退行性疾病，其特征为上运动神经元和下运动神经元的选择性死亡，从首发症状出现后中位生存时间为3年。其临床异质性以及与其他神经系统疾病的表型重叠常常延误准确诊断。由于及时干预可以减缓肌萎缩侧索硬化的进展，疾病过程中的早期诊断可以改善预后。King's临床分期系统通过基于功能受累对疾病负担进行分类，提供了一个有效的框架来评估疾病严重程度并追踪其理论进展连续谱。神经影像研究已识别出肌萎缩侧索硬化中的早期脑改变，提示了病理学的潜在生物标志物。因此，在这些定义的临床分期中研究微观结构改变，可以阐明疾病传播的病理生理学，并识别与临床严重程度密切相关的生物标志物。

弥散磁共振成像是一种无创神经影像技术，通过测量水分子弥散模式来表征肌萎缩侧索硬化中的白质病理。例如，弥散张量成像通过评估水分子在3D空间中弥散的方向和幅度来量化各向异性弥散；两个最常见的弥散张量成像参数是各向异性分数(FA)和平均弥散率(MD)。先前关于肌萎缩侧索硬化的弥散张量成像研究一致表明，皮质脊髓束的各向异性分数降低和平均弥散率升高与更大的疾病严重程度和更快的疾病进展速度相关。然而，弥散张量成像对高斯弥散的基本假设和简化的单隔室模型限制其表征复杂白质微结构的能力，降低了其检测细微病理变化的敏感性和特异性。与传统弥散张量成像相比，高阶弥散磁共振成像模型能够进一步表征肌萎缩侧索硬化中的白质异常。例如，弥散峰度成像揭示了肌萎缩侧索硬化患者白质微结构复杂性的降低，涉及皮质脊髓束、胼胝体中部、枕叶和顶上小叶。神经突方向离散度与密度成像(NODDI)作为一种多隔室生物物理弥散模型，提供了对神经突形态特征的定量描述，并具有生物学意义的指标，如反映轴突密度的神经突密度指数(NDI)和反映纤维方向离散程度的方向离散度指数(ODI)。一系列神经突方向离散度与密度成像研究揭示了肌萎缩侧索硬化患者轴突的异常微观形态，涉及运动相关区域和运动外区域，并导致运动功能障碍和非运动缺陷。这些先进的弥散磁共振成像技术能够更好地检测肌萎缩侧索硬化相关的白质异常，并更精确地量化疾病进展。

基于弥散磁共振成像数据的神经影像证据一致表明，肌萎缩侧索硬化以广泛的结构性失连接为特征。例如，先前的神经突方向离散度与密度成像和弥散峰度成像研究揭示了肌萎缩侧索硬化相关的白质损伤，主要涉及皮质脊髓束和胼胝体，提示自上而下和半球间的结构性失连接。此外，基于弥散张量成像数据的结构性脑网络分析揭示了以双侧初级运动区域为中心的子网络失连接，这是肌萎缩侧索硬化中最关键的病理神经回路之一。此外，全脑结构网络（通过基于弥散的纤维束示踪构建）的拓扑属性异常也是肌萎缩侧索硬化的基本特征。全脑网络结构性失连接的严重程度和拓扑分布可以反映肌萎缩侧索硬化的进展。

值得注意的是，现有的肌萎缩侧索硬化相关弥散研究主要集中于深部白质微结构损伤的检测，涉及投射纤维、连合纤维和长联络纤维。相比之下，短联络纤维是连接同一大脑半球内相邻脑回的皮层-皮层U形纤维，位于浅表白质内。短联络纤维是脑连接组的另一个不可或缺的组成部分，并在支持信息处理和整合的皮层-皮层连接中发挥重要作用。此外，短联络纤维是大脑中最后髓鞘化的部分，这一过程可能持续到生命的第四个十年，增加了这些纤维对损伤的易感性。先前研究表明，短联络纤维对正常衰老过程和神经病理状况特别脆弱。由于短联络纤维的独特特性，包括其小直径、复杂的纤维交叉以及靠近皮层的独特位置，很少有针对浅表白质的研究；现有的弥散磁共振成像技术尚未有效地重建短联络纤维。最近，弥散磁共振成像采集协议和纤维束示踪处理流程的进展使得能够在健康人群和神经退行性疾病个体中可靠地识别短联络纤维。

鉴于结构性失连接代表肌萎缩侧索硬化的关键神经病理特征，短联络纤维（脑连接组的关键组成部分）的微结构性失连接在此疾病中仍然研究不足。因此，此研究的主要目标如下：（i）通过神经突方向离散度与密度成像与传统弥散张量成像相比，阐明肌萎缩侧索硬化患者短联络纤维微观形态损伤的程度和空间分布；（ii）捕捉短联络纤维微结构损伤在肌萎缩侧索硬化进展的临床分期中的进展趋势；（iii）建立短联络纤维损伤与肌萎缩侧索硬化疾病严重程度之间的相关性；（iv）评估与短联络纤维相关的神经突方向离散度与密度成像参数作为区分肌萎缩侧索硬化与健康对照者的在体成像生物标志物的效能。此研究探讨了短联络纤维微结构改变，以阐明其在肌萎缩侧索硬化病理生理学中的关键作用，并识别潜在的短联络纤维衍生生物标志物以评估肌萎缩侧索硬化疾病严重程度。

2.方法  

受试者  

此研究获得福建医科大学附属协和医院研究伦理委员会批准（编号：2021KJT011），并按照1964年赫尔辛基宣言及其后续修正案的伦理标准进行。每位参与者均获得书面知情同意。此回顾性研究纳入37名健康对照者和87名诊断为肌萎缩侧索硬化的患者。肌萎缩侧索硬化诊断遵循修订的El Escorial标准和Awaji标准，疾病严重程度通过修订版肌萎缩侧索硬化功能评定量表 (ALSFRS-R) 评估。疾病进展率计算为。健康对照者主要通过当地社区广告招募，以确保人口学特征与肌萎缩侧索硬化患者组一致。

根据King's量表将肌萎缩侧索硬化患者分为四组，该量表将运动症状的传播分为三个不同区域，以及胃造口或无创通气的需求：第1期表示第一个区域受累(n = 15)；第2期表示第二个区域诊断或受累(n = 36)；第3期表示第三个区域受累(n = 25)；第4A/4B期表示需要胃造口或无创通气(n = 11)。表1总结了参与者的人口学和临床信息。

如果参与者（i）有其他神经精神疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫或重性抑郁障碍；（ii）使用精神活性药物；（iii）有其他严重疾病，包括呼吸衰竭、心血管疾病或癌症；以及（iv）有磁共振成像检查禁忌症，则被排除。参与者招募和排除的总结见附加文件1：图S1。

磁共振成像数据采集  

此研究使用3 T磁共振扫描仪采集多模态图像。弥散加权成像数据通过复杂的多壳层自旋回波平面回波成像序列采集，b值分别为1000、2000和3000 s/mm²，每个b值有30个独特梯度方向。此外，采集了6个b=0图像。相关参数包括：重复时间=4200 ms，回波时间=72 ms，平均次数=1，层厚=2 mm，视野=216 mm×216 mm，矩阵尺寸=108×108，体素大小=2 mm×2 mm×2 mm，翻转角=90°，共72个轴位层，无层间距。相位编码方向从前到后，多波段因子设为2。多壳层弥散加权成像序列的采集时间为7分12秒。此外，此研究采集了T1加权3D磁化准备快速梯度回波矢状位图像，参数如下：重复时间=1610 ms；回波时间=2.25 ms；反转时间=900 ms；视野=224 mm×224 mm；矩阵尺寸=224×224；翻转角=8°；层厚=1 mm；总层数=176；采集时间=3分18秒。

数据处理  

磁共振成像数据处理的流程图如图1所示。具体地，此研究对所有参与者的T1W和弥散磁共振成像图像进行了视觉检查，以识别任何信号丢失或伪影。随后，此研究通过下面概述的成熟流程对图像进行预处理。T1W和弥散磁共振成像数据的预处理程序均从轴向对齐、中心化、基于局部亚体素位移的吉布斯振铃去除以及使用N4ITK进行强度不均匀性校正开始。

对于弥散磁共振成像数据，此研究加入了额外步骤：（1）应用Marchenko-Pastur主成分分析 (MP–PCA) 去噪以在不牺牲空间分辨率的情况下提高信噪比；（2）使用FSL的涡流校正工具校正涡流；（3）通过脑提取工具进行脑掩膜生成；（4）畸变校正涉及将个体T1W和弥散磁共振成像数据集配准。此变换应用于每个弥散加权全脑，梯度向量根据从仿射变换导出的旋转矩阵进行旋转。为了从弥散磁共振成像数据生成脑掩膜，此研究使用了pnlNippye内基于卷积神经网络的分割工具。最后，通过FSL的刚性配准将每个个体的T1W图像从结构空间转换到弥散空间。

生物物理建模  

生物物理建模中采用多种方法从弥散信号中估计隔室特异性体积分数。通过MRtrix3软件包内的非线性张量算子，在b值为1000 s/mm²的每个体素处计算弥散张量。利用估计的弥散张量，随后计算了各向异性分数、平均弥散率、轴向弥散率和径向弥散率。为了从多壳层弥散磁共振成像数据拟合神经突方向离散度与密度成像模型，此研究利用通过凸优化的加速微结构成像工具箱，该工具箱增强了皮层附近区域拟合的速度和稳定性。此外，生成了神经突密度指数、方向离散度指数和各向同性体积分数图。理论上，神经突密度指数作为神经突密度的指标，而方向离散度指数量化了神经突方向的角度变化，特别是其离散和扇形。

短联络纤维的提取  

为了描绘短联络纤维，此研究最初采用概率纤维追踪算法进行全脑纤维束示踪，该算法将混合纤维方向分布函数拟合到弥散信号。纤维方向分布函数通过多壳层多组织约束球面反卷积模型估计。全脑流线通过iFOD1算法生成，参数如下：5000万个随机分布在灰质和白质体积内的种子点，Runge-Kutta四阶积分，15°和30°角度阈值，受解剖组织约束并在灰白质界面裁剪。生成的纤维束示踪图通过SIFT算法进行过滤以减少假阳性连接。

短联络纤维代表位于皮层内或皮层正下方、皮层下白质最外区域中相邻脑回之间的连接。短联络纤维可以通过以下概述的步骤从全脑纤维束示踪中自动识别。首先，此研究通过估计在受试者解剖扫描与图谱之间计算的仿射和非线性变换，将每位受试者的纤维流线扭曲到蒙特利尔神经病学研究所空间。然后汇总所有参与者的空间归一化流线，用于使用自动无监督纤维聚类方法进行群体水平纤维聚类。其次，根据几个标准从全脑纤维束示踪中确定短联络纤维候选者：（i）常见空间中一个团块内流线的平均长度在20至80 mm之间；（ii）流线长度与端点距离之比大于1；（iii）每条流线连接由Desikan-Killiany图谱定义的相邻皮层区域；（iv）没有流线连接两个半球；（v）没有流线涉及特定区域，如胼胝体、丘脑、海马、杏仁核、尾状核、壳核、小脑或脑干。第三，此研究利用TractDL将短联络纤维候选者划分为不同的纤维团块，共得到187个有效的短联络纤维束，这些纤维束以高度一致性自动识别，并根据其连接的皮层区域命名。这187个纤维团块在所有参与者中表现出显著的一致性：187个团块中的185个(98.93%)在每位参与者中都被检测到，而所有187个团块在111名参与者(98.23%)中被观察到。提取的短联络纤维的空间分布见附加文件1：视频S1。

统计分析  

在纤维束标注后计算弥散测量值，以提供纤维束的定量描述。对于每个短联络纤维束，此研究计算了每个测量值沿纤维所有点的平均统计量。采用一般线性模型比较每个短联络纤维束的弥散磁共振成像指标的组间差异，以年龄、性别和受教育年限作为协变量。对于每个弥散指标，进行置换t检验(5000次置换)以确定187个短联络纤维束中每一个的差异。通过Benjamini-HochbergFDR (FDR)方法对每个指标的所有187个纤维束特异性检验进行多重比较校正，显著性设为q < 0.05。

对于显示显著组间差异的弥散测量值，此研究使用偏相关分析探讨其与临床参数（包括 ALSFS -R评分、病程及疾病进展速率）的相关性，同时控制年龄、性别和教育水平等潜在混杂因素。此外，通过受试者工作特征曲线分析(ROC)评估了它们在肌萎缩侧索硬化患者与健康对照者之间的鉴别潜力。为了评估神经突密度指数和各向同性体积分数的联合鉴别性能，构建了一个二元逻辑回归模型。从该模型得出的预测概率用作受试者工作特征曲线分析(AUC)的复合指标，并计算曲线下面积以评估联合分类准确率。

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3.结果  

四组患者和健康对照者在年龄、性别和受教育年限方面匹配（表1）。修订版肌萎缩侧索硬化功能评定量表评分随着肌萎缩侧索硬化临床分期的增加而逐渐降低(p < 0.001)，而疾病进展率在这些分期中增加(p = 0.001)。值得注意的是，四组肌萎缩侧索硬化患者之间的病程无显著差异(p = 0.562)。

图2展示了全脑短联络纤维映射以及在神经突方向离散度与密度成像测量中显示组间差异的纤维。在整个大脑的短联络纤维中，连接左侧中央后-中央前回、左侧中央前-中央前回、右侧中央后-中央前回、右侧旁中央-后扣带回、左侧旁中央-后扣带回、左侧中央前-顶上小叶和左侧中央前-额上回的七条纤维在四组患者和健康对照者之间显示出显著的神经突密度指数差异。此外，一条连接左侧内侧眶额-吻侧前扣带回的纤维显示出各向同性体积分数差异（p < 0.05，FDR校正）（图3）。在这些识别的纤维中，与健康对照者相比，随着肌萎缩侧索硬化分期的进展，观察到神经突密度指数进行性降低和各向同性体积分数增加的趋势（图4和表2）。

在方向离散度指数或弥散张量成像参数中未检测到组间差异。

图5展示了肌萎缩侧索硬化患者中神经突方向离散度与密度成像测量值与临床参数之间的关系。经过FDR校正后，在七条短联络纤维中的神经突密度指数与修订版肌萎缩侧索硬化功能评定量表评分之间发现了显著的正相关。

表3展示了使用每条短联络纤维的神经突密度指数或各向同性体积分数指数进行受试者工作特征曲线分析的结果。通过整合这些神经突密度指数和各向同性体积分数指标 (AUC = 0.780, p < 0.001)，观察到中等的分类能力，如图6所示。

4.讨论  

此研究通过神经突方向离散度与密度成像评估了肌萎缩侧索硬化不同临床分期短联络纤维的微结构损伤模式，并建立了其与疾病严重程度的相关性。主要发现如下：（i）肌萎缩侧索硬化的特征在于短联络纤维内神经突密度指数降低和各向同性体积分数增加。（ii）这些纤维的损伤同时影响肌萎缩侧索硬化患者的运动相关区域和运动外区域。（iii）短联络纤维的微结构损伤随着肌萎缩侧索硬化患者临床分期进展和运动功能障碍加重而恶化。（iv）神经突方向离散度与密度成像提供了与短联络纤维相关的定量生物标志物，用于评估肌萎缩侧索硬化的疾病严重程度和分期。（v）在检测肌萎缩侧索硬化短联络纤维微结构异常方面，神经突方向离散度与密度成像优于传统弥散张量成像。这些发现表明，跨临床分期的脑短联络纤维损伤可作为肌萎缩侧索硬化疾病严重程度的新生物标志物，突显了高阶弥散磁共振成像在阐明肌萎缩侧索硬化病理生理学基础和分层肌萎缩侧索硬化患者中的实用性。

在此研究中，在若干短联络纤维中观察到较低的神经突密度指数，这可能反映了肌萎缩侧索硬化中发生的多种病理过程。先前与深部白质相关的研究通常将神经突密度指数降低与肌萎缩侧索硬化患者的轴突破坏和脱髓鞘联系起来；此外，磁共振成像-组织病理学相关性研究表明，肌萎缩侧索硬化患者短联络纤维中轴突密度降低和髓鞘脱失。因此，短联络纤维神经突密度指数降低可能反映了肌萎缩侧索硬化患者的轴突丢失和髓鞘降解。此外，短联络纤维比深部白质具有更大比例的树突成分。树突退变是肌萎缩侧索硬化中另一个常见的病理特征，也可能部分解释观察到的神经突密度指数降低。除了神经突密度指数降低外，在肌萎缩侧索硬化患者短联络纤维中还观察到各向同性体积分数值增加。尽管很少有磁共振成像-病理相关性研究直接检查肌萎缩侧索硬化个体的短联络纤维，但深部白质的组织学分析通常将各向同性体积分数升高与髓鞘丢失或神经炎症联系起来。这些发现提示短联络纤维中各向同性体积分数升高也可能反映了类似的病理变化。与此研究的预期相反，此研究未发现肌萎缩侧索硬化患者短联络纤维中方向离散度指数有显著变化。这一阴性结果与先前报道一致，表明方向离散度指数改变不是肌萎缩侧索硬化的突出神经病理特征。

此研究揭示了肌萎缩侧索硬化患者短联络纤维的微结构异常，其特征为在所识别的连接左侧中央后-中央前回、左侧中央前-中央前回、右侧中央后-中央前回和左侧中央前-顶上小叶的纤维中神经突密度指数降低。这些发现提示，肌萎缩侧索硬化患者白质纤维束的微结构损伤不仅限于运动相关脑区，还延伸至躯体感觉相关脑区。值得注意的是，这些异常纤维束连接了感觉运动网络内的关键脑区。与此研究结果一致，一项基于网络的统计研究表明，肌萎缩侧索硬化患者感觉运动网络内的结构连接性显著降低，主要影响感觉运动节点之间的双侧和半球内连接。感觉运动网络负责将躯体感觉反馈整合到运动计划和执行中，连接构成感觉运动网络的脑区的短联络纤维微结构损伤可能表明该网络内的通信和协调受损。此研究中发现的肌萎缩侧索硬化患者感觉运动网络内短联络纤维微结构受损，为肌萎缩侧索硬化患者感觉运动网络功能损伤提供了结构证据。此外，相关分析显示，连接构成感觉运动网络的脑区的短联络纤维中的神经突密度指数与肌萎缩侧索硬化患者的疾病严重程度相关，提示感觉运动网络内的结构性失连接可能是导致肌萎缩侧索硬化患者运动缺陷的关键机制之一。

此研究进一步证明，肌萎缩侧索硬化患者中表现出微结构损伤的短联络纤维连接了与感觉运动和高级认知功能相关的脑区。具体而言，这些纤维束包括：（i）连接双侧旁中央-后扣带回的短联络纤维，作为感觉运动网络与默认模式网络之间的结构通路；（ii）连接左侧中央前-额上回的短联络纤维，作为感觉运动网络与认知控制网络之间的结构通路。先前的基于网络的统计也揭示，在肌萎缩侧索硬化患者中，旁中央回与后扣带回之间的结构连接性显著降低；此外，中央前回与额上回之间的结构连接性在肌萎缩侧索硬化患者中显著降低。这些结果与此研究结果一致。既往研究表明，感觉运动网络与默认模式网络之间功能连接增强有利于中风后运动功能的恢复，感觉运动网络与认知控制网络之间功能连接增强有利于辅助运动区综合征患者自主运动和言语障碍的恢复，这表明感觉运动网络与默认模式网络和认知控制网络的功能耦合与运动表现密切相关。基于这些发现，感觉运动网络与默认模式网络/认知控制网络之间的结构性失连接可能是导致肌萎缩侧索硬化个体运动功能障碍的潜在机制之一。值得注意的是，此研究还揭示了连接左侧内侧眶额和吻侧前扣带回的短联络纤维的微结构损伤，这些区域在情绪处理、决策制定和社会行为中发挥关键作用。除了运动缺陷外，肌萎缩侧索硬化患者还表现出认知和行为改变，包括决策困难、情感淡漠、去抑制以及同情和共情丧失。连接左侧内侧眶额和吻侧前扣带回的短联络纤维的微结构损伤可能是肌萎缩侧索硬化患者认知和行为障碍的机制基础。

与先前研究一致，此研究结果也证明，在检测短联络纤维微结构变化方面，神经突方向离散度与密度成像参数优于传统弥散张量成像指标。这种检测优势源于神经突方向离散度与密度成像能够分别量化轴突内退变和细胞外病理，提供比弥散张量成像的复合测量更具体的生物学见解。此外，来自短联络纤维的神经突方向离散度与密度成像衍生指标在肌萎缩侧索硬化患者中随疾病分期进展显示出进行性改变，并与临床疾病严重程度显著相关，突显了它们作为定量生物标志物的潜力。

若干局限性值得承认。首先，此研究的样本量相对较小。这部分归因于晚期肌萎缩侧索硬化患者对磁共振成像扫描的耐受性有限，以及极早期病例可能存在误诊，导致早期和晚期疾病阶段的参与者较少。这一限制可能降低统计功效，从而可能削弱神经突方向离散度与密度成像在辨别组间短联络纤维微结构差异方面的敏感性，并限制研究结果对更广泛肌萎缩侧索硬化人群的普适性。未来需要更大规模和多个心队列的研究来验证和扩展这些发现。其次，未进行随访磁共振成像扫描和临床评估；因此，短联络纤维结构损伤与肌萎缩侧索硬化进展及运动功能障碍之间的因果关系需要通过未来的纵向研究进一步阐明。第三，后续研究应在纤维束示踪过程中采用配备高性能梯度的磁共振成像扫描仪采集的弥散数据。增强的空间分辨率对于准确绘制短联络纤维至关重要，因为它们的长度较短且位于浅表白质区域内，必须仔细处理部分容积效应和复杂的纤维交叉。第四，应同时评估浅表白质中的短联络纤维和深部白质中的较大纤维束；这种方法将有助于更全面地理解与肌萎缩侧索硬化严重程度相关的白质损伤模式。第五，此研究未评估肌萎缩侧索硬化患者的认知功能及进行遗传分层分析，这可能限制对疾病表型的理解。第六，为验证短联络纤维衍生生物标志物对不同运动神经元疾病的鉴别价值，未来的研究应同时纳入其他类型的运动神经元疾病或肌萎缩侧索硬化拟似综合征，以支持鉴别诊断分析。

5. 结论  

总之，在肌萎缩侧索硬化个体中观察到短联络纤维内脑回内和脑回间的微结构损伤，主要表现为影响运动区和运动外区的神经突损伤，并在病程中加重。这一发现强调短联络纤维微结构损伤构成了肌萎缩侧索硬化病理生理学的一个关键要素，并作为反映疾病严重程度的额外生物标志物。此外，神经突方向离散度与密度成像通过更有效地捕获肌萎缩侧索硬化患者的短联络纤维微结构异常，提供了优于传统弥散张量成像的定量生物标志物。