本篇文献分享发表于中科院二区杂志Neurobiology of Disease。本公众号所发布内容旨在与大家分享学术新知，促进交流学习，版权归原作者或原出处所有，感谢各位学者的辛勤成果。

1. 引言

抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎是最常见的自身免疫性脑炎，其发病率超过任何一种病毒性脑炎。临床上，该病表现为广泛的精神神经症状，包括精神障碍、癫痫、运动障碍、认知缺陷、意识改变、自主神经功能紊乱和中枢性低通气。尽管遗传易感性和神经递质失调被认为与抗NMDAR脑炎的发病机制有关，但其确切的病理生理级联反应和具体的神经化学机制仍不清楚。静息态功能磁共振成像提供了一种无创的方法来检查功能活动。在静息态功能磁共振成像指标中，低频振幅分数和局部一致性已被广泛用于表征脑功能活动。fALFF定义为低频范围内血氧水平依赖信号幅度与全频谱幅度之比，具有优异的生理噪声抵抗能力。ReHo量化了神经活动的局部同步性。既往研究已揭示抗NMDAR脑炎患者多个脑区存在广泛的fALFF和ReHo异常，提示内在脑功能组织受损。然而，这些发现仍多为描述性，此类异常背后的神经化学和分子底物尚未得到系统探索。

近年来，分子神经影像和空间转录组学的进展使得脑功能与生物学的多尺度整合成为可能。基于PET的神经递质受体图谱生成了九大系统（包括多巴胺、去甲肾上腺素、血清素、乙酰胆碱、谷氨酸、GABA、组胺、大麻素和阿片类）神经递质受体和转运体的高分辨率图谱。这些图谱不仅揭示了神经递质系统的改变，还允许受体相互作用的动态模拟，为将受体架构与功能影像模式相关联提供了可能，这可能增进对抗NMDAR脑炎功能活动神经化学基础的理解。与此同时，艾伦人脑图谱提供了人类皮层空间分辨的转录组数据，为将神经影像发现与基因表达谱相关联，并阐明宏观神经功能背后的微观分子和细胞底物提供了框架。这种神经影像-转录组整合已成功应用于一系列神经精神疾病，包括重性抑郁障碍、强迫症、偏头痛和精神分裂症，但在抗NMDAR脑炎研究中仍明显缺失。

此研究旨在探讨恢复期抗NMDAR脑炎患者内在脑活动残余性改变的神经化学、分子和细胞相关性。具体而言，首先利用患者和健康对照的静息态功能磁共振成像数据识别异常的fALFF和ReHo模式。随后，进行神经影像-神经递质和神经影像-转录组空间回归分析，将这些功能改变与PET衍生的神经递质受体分布及艾伦人脑图谱的区域基因表达谱分别相关联。最后，进行基因本体富集和细胞类型反卷积分析，以阐明与观察到的脑功能活动改变相关的生物学过程和细胞表型。

2. 方法与材料

2.1 参与者

此研究招募了25例抗NMDAR脑炎患者和30例健康对照。所有参与者均签署书面知情同意书，此研究经安徽医科大学伦理委员会批准。所有患者均符合Graus等人制定的抗NMDAR脑炎诊断标准，经特征性临床表现和血清或脑脊液中NMDAR抗体检测证实。最常见的首发临床特征包括癫痫发作、激动或易怒、言语不连贯。大多数患者接受了一线免疫治疗。至关重要的是，患者组的所有磁共振成像扫描和神经心理学评估均在疾病恢复期进行。

神经心理学评估包括汉密尔顿抑郁量表、汉密尔顿焦虑量表、日常生活活动能力量表、彩色轨迹测试、蒙特利尔认知评估和威斯康星卡片分类测试。所有健康对照均无结构性头部磁共振成像异常，无神经或精神疾病史。

2.2 磁共振成像数据采集与预处理

磁共振成像扫描使用3.0 T磁共振扫描仪进行。所有参与者均取仰卧位，闭眼保持清醒，不进行任何有目的的心理活动。

高分辨率矢状位T1加权结构像采用3D BRAVO序列采集。采集参数如下：重复时间=8.16 ms，回波时间=3.18 ms，反转时间=450 ms，采集时间=283 s，翻转角=12°，矩阵大小=256×256，视野=256 mm×256 mm，层厚=1 mm，体素大小=1×1×1 mm³，共188层。

静息态功能磁共振成像参数如下：重复时间=2400 ms，回波时间=30 ms，采集时间=521 s，翻转角=90°，视野=192 mm×192 mm，层厚=3 mm，体素大小=3×3×3 mm³，共采集46层。

功能磁共振成像数据使用fMRIPrep流程进行标准化预处理。功能数据预处理包括：颅骨剥离、头动校正、时间层校正、与T1加权参考图像配准。应用6 mm FWHM高斯核进行空间平滑。

2.3 局部指标与功能连接分析

为探究与NMDAR功能障碍相关的自发脑活动和功能连接改变，使用DPABI计算fALFF和ReHo。采用双样本t检验进行组水平fALFF/ReHo比较，多重比较采用AlphaSim校正。通过此阈值的区域被认为具有统计学显著性。

将fALFF/ReHo差异显著的脑区峰值坐标作为种子点，用于后续功能连接分析。计算种子点与全脑体素时间序列之间的皮尔逊相关系数，经Fisher r-z变换后，以0.3为阈值。随后采用双样本t检验评估组间连接差异，使用AlphaSim进行多重比较校正。

2.4 神经影像-神经递质回归分析

为探究脑功能活动改变的神经化学特征，使用PET衍生的神经递质受体图谱。基于PET的全脑神经递质受体图谱已被公开，涵盖19种独特的神经递质受体、受体结合位点和转运体，分布于九种不同的神经递质系统。这些图谱为探索神经递质分布与脑功能活动之间的空间关系提供了宝贵资源。

为构建组水平神经递质受体图谱，对每种受体计算加权平均值，权重与贡献研究的样本量成比例。纳入的神经递质靶点包括：5-HT1a、5-HT1b、5-HT2a、5-HT4、5-HT6、5-HTT、A4B2、CB1、D1、D2、DAT、GABAa-bz、H3、mI、mGluR5、MOR、NET、NMDA、VAChT。这些神经递质图谱根据Schaefer图谱被分割为100个感兴趣区，每个区域内所有体素的平均值定义为区域神经递质值。

进行多元线性回归分析，检验19种神经递质受体的空间分布对fALFF/ReHo区域变异的解释程度。使用标准化回归系数评估每种神经递质受体的相对贡献。

为评估这些模型的统计显著性并控制空间自相关，采用空间置换零模型，进行10000次随机球面旋转。并应用10000次自助法重采样估计标准化回归系数的分布，确定每种神经递质受体的相对重要性。

2.5 神经影像-转录组回归分析与基因类别富集分析

使用艾伦人脑图谱的转录组数据，探究与抗NMDAR脑炎患者异常脑功能活动模式相关的基因表达谱、生物学通路和特定神经细胞类型。使用Abagen工具箱，将微阵列表达数据预处理并映射到Schaefer 100个感兴趣区图谱，得到100×15,633的微阵列表达数据集。由于艾伦人脑图谱数据集中右侧半球样本代表性有限，分析仅限于左侧半球数据以确保方法学一致性和统计可靠性。得到包含50个区域×15,633个转录组谱的基因表达矩阵。

采用偏最小二乘回归识别与fALFF/ReHo区域改变相关的基因表达模式。为评估偏最小二乘模型的统计显著性，进行10000次置换检验。使用自助法估计基因权重的稳定性并计算每个基因对应的z分数。选择对第一偏最小二乘分量有显著贡献的基因进行下游富集分析，使用Metascape识别关键生物学过程。

为进一步探究观察到的功能改变的细胞基础，进行细胞类型富集分析。利用先前研究整理的基因列表，该列表整合了五项独立单细胞RNA测序研究中识别的细胞类型特异性基因。富集分析采用总倍数变化法，进行1000次随机置换。

2.6 统计分析

连续变量以均值±标准差或中位数表示。采用双样本t检验、卡方检验和Mann-Whitney U检验比较人口学数据。使用DPABI进行双样本t检验评估两组间fALFF/ReHo差异。多重比较采用FDR和AlphaSim校正。除非另有说明，所有检验均为双侧，显著性水平设为P < 0.05。采用Spearman相关分析检验功能连接与神经心理量表之间的关联，控制年龄、性别和教育水平。显著性阈值设为P < 0.05，采用Bonferroni校正。同时分析了T1信号强度与功能连接的相关性。

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3. 结果

3.1 人口学与临床数据

共纳入25例抗NMDAR脑炎患者（12例男性，13例女性；平均年龄30.20±12.13岁）和30例健康对照（13例男性，17例女性；平均年龄35.23±15.08岁）。两组教育年限相当。性别分布、年龄和教育水平无显著差异。

患者彩色轨迹测试得分显著升高，提示执行功能受损。尽管患者汉密尔顿抑郁量表和汉密尔顿焦虑量表得分也较健康对照升高，但差异未达统计学显著性。相比之下，蒙特利尔认知评估得分存在显著差异，患者得分低于对照，提示认知功能受损。威斯康星卡片分类测试得分在两组间也存在显著差异，反映患者存在认知灵活性和执行功能缺陷。

3.2 抗NMDAR脑炎患者异常的fALFF/ReHo及功能连接

3.2.1 组间fALFF及功能连接差异

抗NMDAR脑炎患者右侧枕叶和右侧颞上回皮层fALFF值显著改变（PFDR < 0.05；图1a和表1）。这两个区域随后用作基于种子点的功能连接分析的种子点。基于种子点的功能连接分析显示，与健康对照相比，患者左侧颞叶与右侧枕叶之间的功能连接显著降低（PFDR < 0.05；图1b）。

图1抗NMDA受体脑炎患者中fALFF及功能连接的改变。

3.2.2 组间ReHo及功能连接差异

与健康对照相比，抗NMDAR脑炎患者左侧额中回ReHo值显著降低（t = -4.83，P < 0.001；图2a和表2）。该区域随后用作基于种子点的功能连接分析的种子点。基于种子点的功能连接分析显示，患者左侧额中回与右侧颞上回之间的功能连接较健康对照显著降低（t = -2.7，P = 0.009；图2b）。

图2抗NMDA受体脑炎患者中ReHo值改变与功能连接的研究。

3.2.3 功能连接与认知行为结局的关联

进行Spearman相关分析，检验功能连接与临床结局之间的关联，控制年龄、性别和教育水平作为协变量。从ReHo和fALFF分析识别的脑区提取功能连接值。具体而言，从ReHo差异区提取的功能连接与彩色轨迹测试得分呈显著负相关（r = -0.55, P = 0.01; 图3a左），与日常生活活动能力量表得分呈显著负相关（r = -0.66, P = 0.001; 图3a右）。这些结果表明，ReHo差异区连接性降低与较差的认知表现和更严重的功能损害相关。

图3功能连接与行为评分之间的Spearman偏相关系数。

此外，从fALFF差异区提取的功能连接与反应一致性得分呈正相关（r = 0.46，P = 0.033；图3b左），而与重复模式错误得分（r = -0.46，P = 0.038；图3b中）和规则错误得分（r = -0.47，P = 0.033；图3b右）呈负相关。这些发现表明执行功能子成分之间存在功能分离，更强的功能连接支持更一致的反应和更少的认知错误。

重要的是，尽管对ReHo和fALFF衍生的功能连接进行了全面的神经心理学量表检验，但未观察到其他统计学显著相关。

此外，T1加权信号强度与fALFF差异区衍生的功能连接之间存在显著正相关（r = 0.44，P = 0.049；图4b），提示潜在的结构特性可能有助于区域间功能整合。

图4 T1加权信号强度与功能连接（FC）之间的Spearman偏相关分析。

3.3 与皮质功能活动改变相关的神经递质系统

为探究抗NMDAR脑炎脑功能改变的神经化学特征，进行多元线性回归分析评估神经递质受体分布与fALFF/ReHo改变之间的关系（图5）。分析显示，5-HT2a受体对患者ReHo改变有显著贡献（P < 0.05）。此外，5-HT2a受体和多巴胺D1受体均与fALFF异常显著相关（P < 0.05）。

图5与抗NMDA受体脑炎中fALFF/ReHo改变相关的神经递质。

3.4 抗NMDAR脑炎的神经影像-转录组回归分析

为系统识别抗NMDAR脑炎脑活动改变的基因表达相关性，结合转录组富集分析进行偏最小二乘回归。PLS1定义为捕捉全皮层基因表达方差与神经影像表型之间最大协方差的空间图。PLS1成分权重的空间分布揭示了与ReHo和fALFF改变相关的区域特异性基因表达谱，反映了功能改变的区域特异性分子基础。

进一步进行富集分析，发现与ReHo改变密切相关的基因主要富集于突触相关神经元发育和投射、少突胶质细胞特化与分化、以及中枢神经系统髓鞘成分生成的生物学过程（图6c）。类似地，与fALFF改变相关的基因富集于突触相关神经元投射发育、天冬氨酸家族氨基酸代谢、以及少突胶质细胞特化与分化及中枢神经系统髓鞘成分生成的生物学过程（图7c）。

此外，细胞类型富集分析显示，与ReHo改变相关的基因主要在星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达，而与fALFF改变相关的基因主要在少突胶质细胞中富集（图8）。

图6与ReHo差异相关的基因表达谱。

图7与fALFF差异相关的基因表达谱。

图8 细胞类型富集。

4. 讨论

此研究采用了整合静息态功能磁共振成像、PET神经递质图谱和转录组数据的多尺度分析框架，探讨了恢复期抗NMDAR脑炎患者脑功能活动改变的神经化学和分子特征。患者在额叶、颞叶和枕叶区域表现出显著的ReHo和fALFF改变。从ReHo和fALFF差异区衍生的功能连接降低，特别是左侧额中回与右侧颞上回之间，以及左侧颞叶与右侧枕叶之间。这些功能连接改变与临床和认知结局（包括日常生活活动能力、彩色轨迹测试和威斯康星卡片分类测试执行功能得分）显著相关，提示其与功能恢复相关。ReHo和fALFF改变与血清素5-HT2a和多巴胺D1受体的空间分布相关。fALFF和ReHo改变相关的区域特异性基因表达谱，主要富集于神经元投射发育、少突胶质细胞特化与分化、以及中枢神经系统髓鞘成分生成等生物学过程。细胞类型富集分析确定少突胶质细胞和星形胶质细胞是这些功能异常的主要细胞贡献者。这些发现为恢复期抗NMDAR脑炎的机制提供了新见解。

5. 结论

此研究揭示，恢复期抗NMDAR脑炎患者脑功能活动改变与血清素和多巴胺受体的空间分布，以及富集于神经发育、髓鞘形成和氨基酸代谢通路的转录组谱密切相关。这些结果部分与现有发病机制一致。胶质细胞，特别是少突胶质细胞和星形胶质细胞，是关键细胞贡献者。这些发现突显了抗NMDAR脑炎脑功能中断的多尺度神经化学和分子机制，并为未来治疗干预提供了潜在靶点。重要的是，此研究建立了一个适用于其他中枢神经系统疾病的方法学框架，为连接分子病理与临床表现提供了机制性见解。