本篇文献发表在Nature Neuroscience杂志。所发布内容旨在与大家分享学术新知，促进交流学习，版权归原作者或原出处所有，感谢各位学者的辛勤付出与研究成果。

1. 引言

自闭症谱系障碍（ASD，以下简称自闭症）的特征是高度异质性的表型表现，涵盖了核心诊断症状及相关特征（如语言、智力、运动和适应功能）的可变表达。这种变异性也体现在多种神经影像内表型中，包括脑激活模式、功能连接和形态测量特征的差异。这种异质性长期以来在神经影像文献中得到认可，相关综述强调了方法学的变异性、发育对脑连接的影响，以及自闭症神经影像领域中更广泛的可重复性问题。近期的研究揭示了在已知与自闭症相关的遗传和生物学过程中存在同样显著的异质性。具体来说，大规模遗传学研究表明，自闭症的高遗传力涉及多种（超过100种）罕见、高外显率突变以及常见遗传风险变异。这些遗传因素单独或共同作用，影响高度异质性的生物学通路，包括突触活动、神经发生、细胞迁移和基因转录。除遗传学外，环境影响，特别是产前炎症状态和免疫功能障碍，也被证明可以调节自闭症风险。

一个常见的假设是，在自闭症中观察到的表型异质性直接反映了潜在的病理生物学异质性。然而，支持这一假设的因果证据尚缺乏。当前的遗传学分析无法实现可靠的自闭症生物学分层，因为只有20%的个体携带临床致病的罕见变异，且没有单一突变占病例的1%以上。鉴于这些局限性，近期的努力集中于在自闭症人群中识别出表型定义的亚型。临床和神经影像表型的统计聚类已被用于识别推定的自闭症亚型——即，以更统一的临床和/或神经表型为特征的自闭症个体亚组，推定代表了不同的病理生物学机制。然而，尽管这种方法具有潜力，其有效性的直接证据仍然难以捉摸。迄今为止，大多数亚型研究缺乏合理的神经生物学验证，最多仅依赖于神经影像指标与标准基因表达模式之间的初步关联。

能够对自闭症相关表型进行生物学解码的跨物种方法或许能弥合这一关键的知识鸿沟，为推动自闭症研究提供一条关键途径。啮齿类动物模型提供了一种独特的实验方法，可以在遗传或环境混杂因素最小的情况下，分离和探究自闭症相关病因因素对脑连接的影响。利用跨物种功能神经成像的技术进步，此研究及其他研究已强调了在临床人群和携带相应自闭症相关遗传变异的小鼠系中，存在显著保守的fMRI连接改变。因此，跨多个自闭症小鼠模型的大规模功能神经成像提供了一个前所未有的机会，可以将自闭症异质性生物学解码为病因学上 不同的连接异常特征，并可能指导跨物种的亚型划分。在这个转化框架内，啮齿类动物模型已被证明在模拟关键的自闭症相关免疫改变，以及构成约20%自闭症遗传架构的多种高外显率罕见遗传变异方面发挥了重要作用。重要的是，死后研究已强调了特发性自闭症中失调的通路与受罕见遗传变异影响的通路之间存在大量重叠，进一步验证了使用啮齿类动物模型探究自闭症相关病理生物学机制的合理性。

基于此观点，此研究推断，跨物种fMRI图解码可以经验性地指导识别自闭症中的脑连接异常亚型，反映出一些在啮齿动物中模拟的生物学通路。通过这种方法，此研究展示了脑功能连接的变异性编码了可分离的生物学通路。具体来说，此研究报道了在20个自闭症小鼠模型中的fMRI连接改变可以聚类为两个主要的低连接和高连接亚型，分别反映了突触通路和转录/免疫相关通路。在这些啮齿动物发现的指导下，此研究在自闭症诊断个体的fMRI扫描中识别了类似的低连接和高连接亚型，并将这些模式与自闭症相关的突触和免疫机制联系起来。此研究证明，特发性自闭症中异质的fMRI连接编码了可分离的病理生物学机制，为自闭症谱系的生物学知情临床亚型划分奠定了基础。

2. 结果

20个自闭症小鼠模型中的fMRI连接异常聚类为主要的低连接和高连接亚型

先前使用静息态fMRI的研究揭示了自闭症个体中非典型连接（此处称为fMRI连接异常）的高度异质性模式。尽管这种异质性常被认为反映了潜在的病因病理学变异，但支持这一假设的直接证据尚缺乏。为了实证探究这一观点，此研究在一个包含20种不同小鼠系的聚合数据库中检验了静息态fMRI连接，这些小鼠系模拟了跨越不同通路（例如，突触机制、蛋白质翻译、转录调控和染色质重塑）以及与自闭症已知相关的免疫相关机制的自闭症相关遗传突变。此研究假设，如果生物学异质性显著导致fMRI观察到的表型变异性，那么连接异常团块应与不同的病因机制相关联，如其基因突变和受影响的转录通路所示。通过使用相对大量的不同小鼠模型，此研究的目标是捕捉自闭症的不同病因图景，使此研究能够经验性地检验此研究的假设。

表1提供了所采用的小鼠模型数据库的详细信息，该数据库是先前描述数据集的扩展。值得注意的是，每个被扫描的模型都包含一个野生型同窝对照小鼠组。这使得能够精确探究表征不同病理机制的fMRI连接改变，且遗传和环境混杂因素可忽略不计。为了促进小鼠研究发现向人类群体的跨物种转化，使用加权度中心性在体素水平上绘制了与每种病因相关的连接差异图。该指标量化了每个体素的平均fMRI连接，并先前在携带系统性自闭症风险的啮齿动物和人类中揭示了类似的脑连接异常特征。

对20个自闭症模型的fMRI连接差异（即突变体对比野生型）的体素级量化揭示了一个连接异常谱，范围从显著的低连接（即突变体中fMRI连接降低）到显著的高连接（即小鼠模型中fMRI连接增加）（图1a，b）。这一发现表明，生物学变异性是与自闭症相关的小鼠模型中连接异质性的关键决定因素。有趣的是，尽管大多数模型表现出低连接和高连接体素的组合，但连接障碍的情况也明显地两极分化，多个小鼠模型表现出主要的低连接（例如，En2, Shank3, 22q11.2, 16p11.2, Ube3A 和 Sgsh）或主要的高连接（例如，Cdkl59[ko], Fmr1, Chd8, Tsc2 和 Il-6）（图1a，b）。与此观点一致，fMRI连接异常的层次聚类揭示了两个主要的亚型，其特征分别为显著的低连接（11个小鼠模型）和高连接（9个）（图1c）。鉴于目标是识别主要的脑连接异常模式，所有后续分析都集中在这两个突出的团块上。

这种双团块方法还为每个亚型提供了足够的小鼠模型数量，以生成稳健的（Cohen's d > 0.8）亚型水平连接异常图。这些图是通过对每个亚型内对应于特定小鼠模型的所有fMRI连接异常模式进行联合分析获得的（图1d）。由此产生的跨病因连接异常图代表了在每个亚型中最容易受到低连接或高连接影响的脑区。

有趣的是，这些亚型特异性图揭示了既有重叠又存在差异的区域模式。一些解剖区域，包括内侧前额叶皮层、纹状体和基底前脑，在各亚型中既易受低连接也易受高连接影响。其他区域则表现出亚型特异性的非典型性。例如，海马和杏仁核主要与高连接亚型相关，而下丘脑和躯体运动皮层则在低连接亚型中表现出非典型性。值得注意的是，每个亚型内突变体与对照小鼠之间的网络比较揭示了可分离的大规模网络系统的参与，表明了不同的非典型的功能组织模式（扩展数据图1）。低连接亚型在突显网络、默认模式网络和海马网络之间显示出广泛的fMRI连接降低，而高连接亚型则显示边缘系统、突显网络和皮层下系统之间的fMRI耦合主要增加。这些结果支持两个啮齿动物自闭症相关亚型包含不同的网络结构的概念，空间重叠也可以忽略不计(皮尔逊的r=0.23，P=0.18)。更广泛地说，这些发现证明了跨20个自闭症小鼠模型的连接异常分为两个主要的、功能上相反的模式。

fMRI低连接和高连接反映了可分离的生物学通路

在小鼠数据库中识别出主要的低连接和高连接亚型，使得能够实证研究不同的自闭症相关连接异常模式是否反映了可分离的生物学通路。为了检验这一假设，此研究生成了两组聚合的分子通路，分别与fMRI低连接或高连接特异性相关。首先在计算机上构建了两个蛋白质-蛋白质 蛋白质-蛋白质-相互作用组，每个包含属于低连接亚型或高连接亚型的遗传和免疫相关病因，以及它们相互作用的基因（图2a）。接着，过滤掉两个 蛋白质-蛋白质-相互作用组中都存在的基因，仅保留每个亚型特异性基因组中独有表示的基因。这一步使后续研究能够专注于可能与低连接或高连接亚型特异性相关的通路。最后应用基因本体论分析，为每个得到的相互作用组识别已知在自闭症中失调的分子通路的富集情况。

利用此方法，此研究识别出一组与低连接性或高连接性相关的自闭症相关分子通路。值得注意的是，这些通路具有显著的可分离性（图2b）。具体而言，低连接性亚型在多种突触相关本体论中表现出显著富集，包括涉及突触蛋白质-蛋白质相互作用的基因（比值比(OR) = 7.54，P_FDR = 10⁻⁹）、跨化学突触传递（OR = 6.01，P_FDR = 10⁻²⁰）以及突触功能（SynGO，OR = 5.32，P_FDR = 10⁻⁴²）。此亚型还显著富集了在突触稳态和可塑性调控中起关键作用的多效性分子效应物，如MAPK信号（OR = 6.92，P_FDR = 10⁻⁴³）、膜转运（OR = 3.12，P_FDR = 10⁻⁸）、蛋白质翻译（OR = 5.43，P_FDR = 10⁻²⁹）和WNT信号（OR = 5.14，P_FDR = 10⁻¹⁹）³⁷˒³⁸。而免疫相关机制，如先天免疫（OR = 1.86，P_FDR = 10⁻⁸）、适应性免疫（OR = 2.06，P_FDR = 10⁻¹³）和细胞因子信号（OR = 2.68，P_FDR = 10⁻¹¹），则在此亚型中仅呈现弱代表性。

为了评估这些结果对于不同基因本体集的稳健性，此研究使用先前在自闭症个体死后脑组织中被描述为失调的基因模块重复了富集分析。与此研究最初的发现一致，低连接性亚型显著富集了包含参与突触活动调控基因的模块，如囊泡运输与释放（OR = 2.16，P_FDR = 10⁻⁸）以及突触囊泡与可塑性（OR = 1.98，P_FDR = 10⁻⁴）。相反，高连接性相互作用组显著富集了参与免疫信号的基因模块，如免疫反应（OR = 2.2，P_FDR = 10⁻³）和小胶质细胞（OR = 4.73，P_FDR = 10⁻¹⁷）（图2c）。需要注意的是，由于Gandal等人的数据集¹⁶未包含与转录调控明确相关的模块，因此无法评估该通路的可重复性。综上所述，这些结果表明，可分离的机制支撑了自闭症中功能磁共振成像连接异常的不同模式，突触功能障碍与功能磁共振成像低连接性相关，而免疫和转录失调则更显著地与功能磁共振成像高连接性相关。

在人类数据中可以识别出可重复的低连接和高连接亚型

如图3所总结，在啮齿动物数据库中识别出两种主要的脑连接亚型后，此研究探究了这些发现在人类中的相关性。具体来说，利用fMRI连接的跨物种可转化性，询问是否可以在一个包含特发性自闭症个体的大型fMRI扫描数据库中识别出类似的低连接和高连接亚型。这种方法之后是对人类数据中获得的自闭症相关低连接和高连接图进行基因解码。

此研究检查了一个聚合的低运动静息态fMRI人类数据集，包括940名自闭症谱系个体和1036名年龄匹配的神经典型对照。所探究的数据集包含38个数据采集库，其中37个选自自闭症脑成像数据交换存储库，另一个是在儿童心智研究所新近聚合的样本（表2）。为了评估亚型的可重复性，将此聚合数据集先验地分为一个发现数据集（占聚合样本的78.5%，包括744名自闭症个体和807名神经典型对照）和一个复制数据集（占聚合数据集的21.5%，包括196名自闭症个体和229名神经典型对照），这些数据集在诊断、性别、年龄和扫描仪内头动方面进行了匹配。

低连接和高连接亚型表现出不同的网络结构并在行为上可区分

研究进一步表征了人类亚型的网络结构、相关的认知本体论图和自闭症症状学。为了增加统计功效，分析是在结合了亚型发现和复制队列的聚合数据集上进行的。亚型内自闭症与神经典型数据的网络比较揭示了特定的网络非典型性。在高连接亚型中注意到皮层下-皮层连接显著增加和颞顶叶、视觉及躯体运动网络之间的皮层-皮层连接减少。在该亚型中，最大的差异包括皮层下区域内（53%的节点-节点连接）及其与突显网络的连接（414个皮层和皮层下分区中的44%）的连接增加。相反，低连接亚型显示出显著的网络水平差异，涉及躯体运动和颞顶叶网络之间连接的减少（5%的连接）。支持两种亚型不同的网络组织，其连接矩阵显示出可以忽略的的空间重叠（r = 0.07, P = 0.53）。有趣的是，尽管存在一些物种特异性差异，这些网络模式与在啮齿动物中观察到的基本一致，在主要系统间显示出相似的低连接和高连接方向性和组织。这些发现表明，识别的低连接和高连接模式代表了两种功能上 不同 的亚型，其特征是潜在不同的脑网络架构。与此观点一致，反向推断映射揭示这两种亚型的网络结构与 不同 的本体论认知图相关联。具体来说，低连接亚型的连接图与眼动、语言和认知区域重叠，而高连接图与感觉、内脏、运动、奖赏和抑制控制区域相关联（图4f）。

最后，为了评估两个自闭症相关亚型的行为特征，使用自闭症诊断观察量表第二版（ADOS-2）基础的严重程度总分和子量表分数比较了自闭症症状严重程度，这些分数在个体子集中可用。平均而言，高连接亚型中的个体相对于低连接亚型中的个体表现出中度增加的总CSS（低连接亚型n=38，平均值=6.1±2.5；高连接亚型，n=87，平均值=7.1±1.9；t₁₂₃=2.20，P_uncorr=0.020，P_FDR=0.030）。如图4g所示，症状子域严重程度分数的比较揭示了社交情感而非限制性重复行为（RRB）分数的亚型差异。探索性分析显示，亚型之间在其他可用表型数据（包括年龄、智商、性别、精神共病发生率和药物使用状态）方面无统计学显著差异（补充表1）。值得注意的是，fMRI连接强度与ADOS分数相关（补充图5）。总之，这些发现表明，识别的低连接和高连接亚型表现出不同的功能网络模式和自闭症症状严重程度。

人类的低连接和高连接概括了在啮齿动物模型中识别的分子通路

鉴于在自闭症个体中存在相似的连接亚型，研究了它们是否也反映了类似的分子机制。使用空间基因解码，识别了两组亚型特异性基因，它们在识别的低连接和高连接亚型中空间富集。接着，过滤掉两个亚型都空间富集的基因，仅保留每个亚型特异性基因组中独有表示的基因。这一步使后续研究能够专注于更可能独属于低连接或高连接亚型的通路。接下来询问这些基因组是否富集了自闭症相关转录本，以及它们是否概括了在小鼠低连接和高连接亚型中观察到的分子通路。

支持跨物种方法有效性的同时，两种连接异常亚型均显示出对自闭症个体死后皮层中差异表达基因的显著空间富集（低连接，OR=1.87, P_FDR=10^-3；高连接，OR=1.88, P_FDR =10^-3，图5a）。值得注意的是，两种亚型均未显示出与双相情感障碍、银屑病、痴呆、注意缺陷/多动障碍或精神分裂症相关基因的显著富集（补充图6）。

在已确定解码的基因集富集了自闭症相关基因之后，此研究接下来使用通路特异性基因本体分析探究了它们的生物学功能。该分析显示，这两种亚型与不同的生物学通路相关，反映了在相应啮齿类动物连接亚型中观察到的特定分子功能障碍（图5b,c）。具体而言，低连接性亚型的脑解码基因在多个突触本体论中表现出强健的富集，例如突触处的蛋白质-蛋白质相互作用（OR = 0.92，P_FDR = 10⁻⁶）、跨化学突触传递（OR = 2.26，P_FDR = 10⁻⁷）、SynGO（OR = 2.19，P_FDR = 10⁻¹⁴）以及膜转运（OR = 1.44，P_FDR = 10⁻²）。相比之下，高连接性亚型在免疫相关通路中特异性地富集，如细胞因子信号（OR = 1.66，P_FDR = 10⁻³）和先天免疫系统功能（OR = 1.43，P_FDR = 10⁻²）（图5b），但在突触本体论中未显示富集（所有P_FDR > 0.05）。与此研究在啮齿类动物数据集中观察到的情况不同，此连接亚型中未观察到转录机制的富集。使用自闭症大脑中差异表达的基因模块¹⁶重复进行的基因富集分析揭示了低连接性亚型中显著的突触富集（例如，囊泡运输与释放，OR = 5.14，P_FDR = 10⁻⁵⁶；突触囊泡与可塑性，OR = 4.38，P_FDR = 10⁻²⁶）以及高连接性亚型中免疫相关的富集（例如，免疫反应，OR = 3.57，P_FDR = 10⁻¹³；反应性小胶质细胞，OR = 1.79，P_FDR = 10⁻²）（图5c）。这些结果表明，与功能磁共振成像连接异常亚型相关的病理通路具有跨物种保守性。类似地，此研究还发现，在啮齿类动物连接异常亚型中富集最稳健的本体论或基因模块，与在相应人类亚型中富集更为突出的那些之间，存在广泛的对应关系（图5d,e）。总体而言，这些结果证实了此研究跨物种解码的机制有效性，并揭示了自闭症中两种突出且可重复的大脑连接异常亚型背后的分子功能障碍。

3. 讨论

通过在大型队列中使用跨物种功能神经成像，此研究将自闭症相关的异质性fMRI连接异常模式生物学解码为两个可重复的亚型：一个主要特征为全脑低连接，另一个为广泛高连接。值得注意的是，基因解码和富集揭示，识别的低连接和高连接亚型分别与突触功能障碍和免疫相关机制相关联。从转化的角度来看，此研究结果证明了使用跨物种方法将广泛研究的自闭症神经影像表型经验性地解码为机制上可分离的亚型的可行性。这些发现也支持了自闭症中异质性脑连接异常反映其潜在病因异质性的观点，从而为正在进行的谱系神经生物学亚型划分工作提供了实证支持。

基于并扩展了先前的啮齿动物fMRI数据库，此研究调查了广泛的自闭症相关病因学小鼠模型。研究结果提供了令人信服的证据，表明非典型功能连接及其跨病因异质性是自闭症的一个决定性病理生理学标志，并与不同的信号通路相关联。利用具有转化相关性的聚合连接异常度量，跨物种分析揭示了关于自闭症相关fMRI连接异常分子基础的新的生物学见解。在低连接亚型中发现的多个突触本体论的富集暗示了突触功能障碍在改变大规模fMRI连接中的核心作用。这一现象最近在理论和实验水平上都有所研究，揭示了兴奋性突触密度与此处使用的聚合fMRI连接度量之间存在推定的直接共变关系。在低连接亚型的多个小鼠系中观察到的兴奋性树突棘密度降低，如Shank3, Cntnap2, Syn2, 16p11.2和22q11.2，广泛支持了这一假设，并表明突触稳态的改变（推定导致突触密度降低）可能代表了观察到的低连接的一个合理的神经细胞标志物。

高连接与免疫相关信号传导之间稳健的跨物种关联也非常引人关注，因为它表明多种免疫介导的通路汇聚在一起，驱动哺乳动物大脑中的非典型功能耦合。这可能通过免疫介导的兴奋或抑制功能改变、微结构白质异常、小胶质细胞诱导的轴突连接和突触修剪改变，以及免疫相关的突触发生破坏而发生。该框架为先前的人类fMRI证据提供了一个可测试的机制解释，该证据表明高连接与自闭症个体社交互惠能力的脆弱性相关，支持了发现的转化相关性。

重要的是，多种免疫相关机制已被证明直接影响突触成熟和稳态。在此框架内，fMRI高连接可能部分反映了免疫相关的兴奋性突触过剩。观察到高连接亚型中的多个小鼠模型，如Cdk15、Tsc2和Chd8单倍剂量不足小鼠，以及免疫相关模型如产前接受IL-6处理的小鼠和Trem2缺陷小鼠，据报道至少在出生后早期阶段表现出突触密度增加，这与这一观点一致，并证实了新出现的将突触功能障碍与宏观fMRI连接异常联系起来的证据。

在啮齿动物中的神经调控研究也使能够推测观察到的fMRI连接异常的潜在神经生理学决定因素。具体来说，使用化学遗传学和多电极电生理记录，最近描述了皮层兴奋性与fMRI连接之间的反比关系。发现增加的神经放电和皮层兴奋性可能导致fMRI连接降低，而皮层兴奋性降低则可能导致fMRI连接增加。根据这个模型，fMRI低连接和高连接亚型可能分别反映了广泛增加的皮层兴奋性或过度抑制。在这方面，结果为长期以来关于自闭症兴奋/抑制失衡的理论提供了一个系统层面的框架，并对其进行了扩展。通过将分子和转录组特征与fMRI网络耦合的相反模式联系起来，发现表明激励抑制失衡可能在宏观层面上表现为不同模式的网络连接异常。自闭症谱系内可能存在相反的兴奋性功能障碍，这与最近通过脑电图测量的、以兴奋性增加和减少为特征的电生理学上相反的自闭症亚型的识别相一致。这种跨模态的收敛性表明，自闭症中的E/I失衡可能不是一个单一现象，而是一个多维度的构念，其表达可能因个体和发育阶段而异，这或许可以解释自闭症相关脑连接的异质性。这一假设需要在啮齿动物和人类中进行进一步的实证检验，并可能对自闭症分层或治疗产生重要影响。

此外，此研究注意到大规模fMRI连接也可以由神经化学和神经调节系统调节。起源于基底前脑、丘脑或下丘脑核团的胆碱能、血清素能或多巴胺能张力的差异（这些核团似乎在两种亚型中都受到影响）可能因此直接或间接地影响观察到的低连接和高连接模式，或是通过塑造皮层兴奋性，或是通过影响血氧水平依赖（BOLD）fMRI信号的血管机制。未来结合fMRI与神经调节活性直接测量的研究对于阐明这些系统对自闭症大规模连接改变的贡献至关重要。

有趣的是，这种功能划分似乎并不直接或明确地反映小鼠的潜在解剖学变化。在最近一项涵盖135个小鼠模型的大规模解剖聚类研究中，包括此研究考察的10个模型，发现低连接和高连接模型均匀分布在三个（共四个）不同的神经解剖学子组中，没有对任一连接剖面表现出优先富集。这种分离表明，功能和结构改变捕捉了自闭症表型的部分独立成分，强化了将fMRI连接与解剖学和分子读数整合起来的多维框架的需求。

尽管跨物种方法主要关注两个主要的低连接和高连接亚型，但实施的相对粗略的划分可能阻碍了对额外连接异常亚型和更精细的分子改变集的检测。例如，一套无法在人类中可靠解码的通路是转录失调，在小鼠中它与免疫功能障碍共聚类。可以想象，通过扩展数据库以包含更多小鼠模型，这两种不同通路产生的模式可能变得进一步可区分。或者，转录失调可能无法可靠地连接到不同的连接异常模式，因其发育结果的高度随机性。这一假设与在不同遗传背景上删除染色质调节因子Chd8时观察到的表型变异性一致。与此观点一致，人类fMRI图的基因解码中缺乏稳健的染色质/转录信号表明，此类机制不太可能是特发性自闭症中大规模连接异常的主要贡献者。同样重要的是要注意，富集结果不应被解释为表明分子通路对任一亚型具有绝对排他性。相反，它们表明识别的突触和免疫/转录机制可能塑造连接改变向低连接或高连接的极性，而这是在多种机制可能共存的异质性生物学背景之上。这种细微差别与自闭症复杂的病因是一致的，并强调了对研究的结果进行比较而不是绝对解释的价值。

尽管啮齿动物和人类之间存在巨大的进化距离，且目前无法在啮齿动物中有效模拟常见的多基因变异，但跨物种方法成功地解码了在非综合征性、特发性自闭症个体中获取的约四分之一fMRI扫描（这些个体没有已知的单一基因突变）。这一发现强调了方法的转化潜力，并表明尽管存在关键的跨物种差异，但在人类fMRI扫描中可以解码普遍存在的自闭症相关病理生理学改变。这一结果也强化了先前的证据，即在特发性自闭症中失调的通路（被认为反映了常见遗传变异的累积贡献）与可以在啮齿动物中可靠建模的罕见、高外显率突变所影响的通路之间存在大量重叠。

尽管目前的框架尚未捕捉到自闭症相关脑连接异常的全部谱系，但结果为扩展这种方法提供了坚实的基础。在基因特征明确的自闭症个体中整合功能神经成像，以及未来扩展啮齿动物数据库以包含更多突变和机制，对于进一步完善这些见解至关重要，并有可能揭示此处描述的主要高连接和低连接亚型之外的额外连接异常亚型。未来采用性别平衡队列的研究对于系统评估潜在的性别与亚型交互作用，以及确定相似的生物学原理是否在性别间普遍适用也至关重要。此研究还注意到，缺乏亚型分类的扫描并不必然表现出典型连接，也不意味着该群体中推定的连接改变与潜在病因无关。相反，这表明自闭症中的非典型fMRI连接存在于一个更细微的连续谱上，通常以传统病例对照比较无法轻易检测的方式表现出来。通过完善分析方法和扩展数据集，未来的研究可能捕捉到更广泛范围的非典型连接亚型，进一步丰富对自闭症病因学多样性的理解。最后指出，此研究的主要目标并非立即临床应用，而是在宏观fMRI连接模式与潜在生物学变异性之间建立概念联系。目前，这两个亚型应被视为观察性发现；然而，它们为未来的工作提供了一个框架，将连接定义的亚型与特定的生物学或神经生理学改变联系起来，并最终在机制靶向研究中对内表型进行分层。在这些方法能够为临床转化提供信息之前，还需要进行大量额外的验证。

在两个自闭症亚型中观察到的症状严重程度差异，尽管它们的功能架构大体相反，这支持了未来研究旨在检查更细粒度症状评分的努力。事实上，更深入和更协调的表型分析是未来转化和临床亚型验证的关键步骤。尽管如此，证明了fMRI可以编码复杂的生物学通路，这表明fMRI在神经和精神科学研究中有着广泛的用途，而不仅仅是建立脑-行为关联。

总之，结果将自闭症重新定义为一种以可区分的神经生物学亚型为特征的神经发育障碍，并提供了将自闭症谱系的表型异质性与其潜在的生物学变异性联系起来的实证证据。此工作还为自闭症的生物学提供了新的见解，强调了突触和免疫相关机制在驱动自闭症相关功能连接异常中的作用。最后，从方法论的角度来看，跨物种方法为自闭症的多维、生物学基础分层提供了一个先进的转化框架。数据库对研究界开放，以支持未来对自闭症相关连接改变的研究。

4.方法

统计考量

没有使用统计方法来预先确定样本量。样本量由在此研究分析的聚合小鼠和人类fMRI集合中数据的可用性决定，并且与先前大规模神经影像研究中使用的样本量相似或超过。假设大多数数据分布是正态的，但未进行正式检验。分析主要关注效应量（Cohen's d），它可以在没有严格分布假设的情况下计算；在适当的地方，显示了单个数据点。随机化不适用于组分配，因为实验组由基因型（小鼠数据集）或诊断（人类数据集）定义，数据处理和分析在各组中应用相同。数据分析使用自动化的、脚本化的流程进行，所有数据集应用相同；组标签在处理过程中编码，仅在初步分析完成后解码。

小鼠研究

伦理声明。 所有研究程序均经机构审查委员会批准，并符合1975年《赫尔辛基宣言》（2008年修订）的道德标准。在意大利技术研究院进行的所有实验均遵循意大利法律以及美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议。在苏黎世联邦理工学院进行的所有实验均符合瑞士关于在研究中使用动物的联邦指导方针，并在苏黎世州兽医局许可下进行。动物研究方案也由意大利技术研究院和苏黎世联邦理工学院的动物护理委员会审查和批准。在两个机构，小鼠在受控温度和湿度下群养，并维持标准的12小时光/暗周期。食物和水可随意获取。

自闭症小鼠模型。如表1所详述，在20个自闭症相关模型中收集的fMRI扫描包括从两个实验室回顾性聚合的已发表和未发表实验的数据。具体来说，在意大利技术研究院扫描了12个小鼠模型，在苏黎世联邦理工学院扫描了8个。每个研究包括了具有自闭症相关改变的小鼠和野生型同窝对照小鼠。其中17个模型携带与自闭症相关的遗传改变。其余包括一个母体暴露于IL-6的环境自闭症风险因素模型；一个以微胶质细胞缺陷和自闭症样行为表型为特征的TREM2缺陷模型；以及近交系BTBR小鼠。BTBR小鼠系的特点是先天性胼胝体发育不全，这是一种与自闭症高患病率相关的神经解剖学特征。在BTBR小鼠的相同fMRI扫描期间成像了一组年龄匹配的C57B6J小鼠，并代表该系的参考对照。

静息态fMRI。 使用小动物磁共振系统，在受控镇静下扫描小鼠。来自意大利技术研究院的扫描使用72毫米鸟笼发射线圈和定制设计的马鞍形四元件接收线圈获取。来自苏黎世联邦理工学院的扫描使用低温正交表面线圈获取。标准调整包括参考频率功率的校准和使用MapShim进行匀场。使用标准平面回波成像序列采集静息态fMRI BOLD时间序列，如前所述。在所有fMRI采集中，对于苏黎世采集的数据，使用异氟烷(0.5%)+美托咪定(0.05 mg kg⁻¹)获得受控镇静；对于在意大利技术研究院采集的数据，使用氟烷(0.75%)获得受控镇静，但在异氟烷和美托咪定下成像的Oxtr基因敲除除外。

静息态fMRI连接图绘制

在绘制功能连接之前，对自闭症相关小鼠模型和野生型同窝对照小鼠的fMRI时间序列进行预处理。预处理包括两个连续的步骤：核心预处理和去噪。核心预处理包括以下步骤（括号内为所用的软件和功能）。移除时间序列的前50个时间点以允许T1和梯度热平衡效应，去尖峰，运动校正，去颅骨，并通过仿射和微分同胚配准进行空间归一化到一个去颅骨的参考BOLD模板。去噪流程包括以下步骤：六个头动参数（三个平移+三个旋转）和平均脑室信号被用作噪声协变量，从每个时间序列中回归掉。然后，对噪声回归后的时间序列进行带通滤波到0.01-0.1 Hz的频率窗口，并使用半高全宽为0.6 mm进行空间平滑。

fMRI连接性通过对所有小鼠使用加权度中心性的体素级计算来量化预处理后的时间序列。在此将此参数称为“全局连接性”。全局连接性对应于给定体素与脑内所有其他体素的平均时间Pearson相关性。这种方法允许获得空间无偏的连接性图，而不受预先设定的解剖边界限制。全局连接性也适用于直接的跨物种转化。首先使用费舍z变换将Pearson的相关性分数转换为z分数，然后对体素进行平均以得出最终的全局链接强度。最后，使用Cohen's d在体素级量化每个自闭症模型及其对照同窝小鼠之间全局连接强度的差异。每个自闭症相关小鼠模型的Cohen's d全局连接图然后使用R包“ggplot”中实现的全局直方图分析进行绘图。体素级全局连接图绘制使用Python 3中的定制代码实现。

自闭症相关小鼠模型中的fMRI连接异常亚型划分

为了识别跨病因的fMRI连接异常模式，将聚类分析应用于Cohen's d全局连接图。为此，在将这些统计图向量化后，创建了一个连接矩阵，其中行是自闭症相关小鼠模型，列是脑体素。然后应用凝聚层次聚类来识别表现出相似Cohen's d全局连接图的小鼠模型，如R包'heatmap.2'中实现的那样。使用树状图可视化自闭症相关小鼠模型之间的相似程度并划分团块。相似性通过使用欧几里得距离量化。为了可视化不同团块数目下小鼠fMRI连接异常的异质性，绘制了fMRI连接异常分数的组内平方和作为团块数目的函数（补充图7）。为了确定最佳团块数，使用了NbClust并搜索了多达10个团块的解决方案。由R函数NbClust计算的16个指数显示k=2是最优解。在补充图7中，还报告了随着k增加（即超过最优k=2划分）分组到最小团块中的小鼠模型数量。该分析显示，k=2时的团块包含了相当数量的模型，确保了稳定性和可解释性。更高的划分数字（即k=3及以上）则与至少一个仅包含两个模型的团块相关联。考虑到(1) NbClust显示k=2为最优划分，(2)目标是识别可以稳健地转化到人类脑扫描的主要脑拓扑结构，以及(3) k>3的划分将由仅两个小鼠模型组成，保留了k=2用于所有后续分析。

为了排除MRI扫描位点或麻醉方案影响fMRI连接图，通过仅对野生型同窝对照小鼠进行层次聚类来评估结果的位点独立性（补充图8）。然后量化了每个结果团块中在每个位点采集的动物比例。发现对照同窝小鼠在两个团块中均匀地分布在各位点，与原始数据库的组成一致。此外，野生型对照的聚类没有重现病因学低连接和高连接亚型的分布，因为每个野生型团块都包含了来自两组的均衡比例的对照（补充图8）。这些分析表明，识别的亚型不是由位点依赖因素驱动的。

为了识别在每个团块中显示出显著跨病因fMRI连接异常的脑区，首先在Cohen's d > 0.8处对其全局连接图进行阈值化和二值化，然后计算每个亚型中自闭症相关小鼠模型的连接图。使用联合图可以识别出在属于同一亚型的至少两个小鼠模型中一致显示低连接或高连接的脑区。这些分析生成了两个不同的联合图，一个显示主要低连接的脑区，另一个显示主要高连接的脑区。

功能网络图绘制

为了研究与每个亚型相关的fMRI网络非典型性，使用基于网络的统计计算了网络内部和网络之间的fMRI连接性。为此，首先从64个皮层和皮层下分区中提取fMRI时间序列。皮层区域被分组到9个静息态功能连接网络中。然后使用时间Pearson相关性计算每个脑扫描的ROI到ROI功能连接矩阵。接下来，跨小鼠模型回归掉全脑平均连接信号。这一步允许评估每个亚型图的网络组织，超越表征两种自闭症亚型的一般高连接和低连接。最后，使用NBS中实现的非配对t检验来识别每个亚型内自闭症小鼠模型与同窝对照之间罕见的功能连接差异。使用FWER对多重比较的统计结果进行校正。将单变量阈值设为t > 3.1，网络显著性设为P = 0.05（双尾），并进行了5000次置换。这为每个亚型生成了一个组水平的功能连接矩阵，显示了在网络内部和网络之间存活的NBS统计阈值的ROI到ROI fMRI连接的绝对数量。考虑到功能网络具有不同的大小（因此由不同数量的ROI组成），通过网络内部和网络之间的总ROI到ROI fMRI连接数对功能连接矩阵进行了归一化。使用R包'circlize'中实现的功能连接图显示每个亚型的网络级fMRI连接差异。

基因富集分析

为了研究自闭症相关连接异常的不同模式是否反映了可分离的生物学通路，进行了基因富集分析。该分析比较两个基因列表，使用超几何检验统计检验一个列表中的基因集是否在另一个列表中的代表性高于偶然。基因富集分析是在分组到小鼠模型两个亚型中的自闭症相关基因列表（加上它们的相互作用基因）和索引已知与自闭症相关的分子通路的基因列表之间进行的。为此，创建了两个计算机模拟的蛋白质-蛋白质巨型相互作用组，一个用于低连接亚型，另一个用于高连接亚型。每个蛋白质巨型相互作用组包括聚类到低连接或高连接亚型的所有基因（由相应小鼠模型推断），以及它们的相互作用基因。为了搜索那些相互作用基因，使用STRING-DB进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析。对于单基因小鼠模型，在蛋白质-蛋白质相互作用分析中使用单个突变或敲除基因作为种子。对于16p11.2和22q11.2，对包含在这些两个拷贝数变异中的所有基因进行了同步的基于种子的分析。作为一种与特定遗传改变无关的近交系模型，BTBR小鼠被排除在此分析之外。总的来说，这些分析为每个自闭症病因生成了一个包含多达100个基因的蛋白质-蛋白质相互作用组。然后聚合每个连接异常亚型内小鼠模型的相互作用组，创建两个蛋白质-蛋白质相互作用组。该分析产生了一个与fMRI低连接相关的基因蛋白质-蛋白质相互作用组和另一个与fMRI高连接相关的基因蛋白质-蛋白质相互作用组。接着，过滤掉两个蛋白质-蛋白质-相互作用组中都存在的基因，以保留那些在任何一个蛋白质-蛋白质-相互作用组中独有表示的基因，分别得到低连接和高连接亚型的基因。这一步使研究能够专注于特定与两种连接异常亚型相关的通路。对于每个相互作用组，接下来应用基因富集分析来识别已知在自闭症中失调的分子通路的富集情况。分子通路包括适应性免疫系统、染色质组织、免疫系统中的细胞因子信号传导、基因表达转录、先天免疫系统、MAPK家族信号级联、膜运输、mTOR信号传导、神经系统发育、突触处的蛋白质-蛋白质相互作用、GPCR信号传导、WNT信号传导、翻译和跨化学突触的传递。分子通路的本体论从网站上下载。除了分子本体论，还对一组手动整理的突触基因列表进行了基因富集分析。

为完整起见，在补充图9中报告了共享基因列表的富集情况。所有主要通路（除染色质组织外）在此共享基因组内均显著富集。这是一个预期结果，因为该基因组在很大程度上反映了最初构建相互作用组所依据的病因学。为了识别偏向fMRI网络变化至低连接或高连接的分子通路，在此研究中仅分析了每个亚型特异性基因组池，即去除了数据库中表示的共享基因。这种方法在概念上与全基因组关联研究相关：一旦解释了共享机制，就可以识别区分网络变化朝向低连接或高连接的不同生物学过程。

为验证此研究的基因富集分析对相互作用组大小（即相互作用基因的最大数量）的稳健性，此研究使用包含多达500个基因的相互作用组重复了富集分析。该分析得到高连接性亚型相互作用组包含n = 1,793个基因，高连接性亚型包含n = 1,526个基因。在过滤掉低连接性和高连接性巨型相互作用组共有的n = 377个基因后，此研究获得了n = 1,416个独特属于低连接性亚组的基因和n = 1,149个独特属于高连接性亚组的基因。使用这些更大的巨型相互作用组进行的富集分析产生的比值比与使用较大巨型相互作用组获得的结果高度相似，从而排除了相互作用组大小可能驱动结果的可能性（扩展数据图2）。当此研究将相互作用基因网络缩小到50、25或10时，也获得了类似的富集结果（扩展数据图2）。最后，在元相互作用组与据报道在自闭症个体死后脑组织中差异表达的共表达模块的基因之间进行了补充富集分析¹⁶。此分析仅考虑了已知生物学功能的共表达模块（n = 10¹⁶）。富集程度通过超几何统计检验测量，并以比值比和P值（FDR校正，q < 0.05）进行量化。基因列表和相互作用组列于补充表2。

人类研究

样本。 为了识别由生物学相关的啮齿动物连接异常亚型启发的自闭症亚型，分析了来自940名特发性自闭症个体和1036名神经典型对照的静息态fMRI时间序列，包括38个数据采集库，其中37个选自两个ABIDE数据存储库，另一个是最近在CMI聚合的。每个贡献站点均获得了伦理批准，并根据当地机构审查委员会/伦理委员会的要求获得了参与者的知情同意和/或同意。纳入了年龄在5-30岁之间的个体数据。如补充图10中的数据选择流程图所示，仅保留了帧间位移≤0.2毫米且成功配准到MNI标准空间的参与者脑扫描。每个采集库的详细信息，包括扫描参数，可在网站上找到。关于CMI数据收集的详细信息在相关参考文献中报告。分析中包含的聚合样本的人口统计学和临床信息总结于表2。

静息态fMRI预处理

在绘制fMRI连接之前，使用C-PAC版本1.6.2预处理fMRI时间序列。简而言之，将数据重采样到RPI方向，并进行切片时间校正。接下来，使用两阶段方法进行运动校正，其中时间序列首先配准到时间平均fMRI图像，然后计算新的时间平均值并用作第二次配准的目标。在此第二阶段，基于Friston 24参数模型计算运动参数以及帧间位移。然后对运动校正后的时间序列进行去颅骨处理，并基于平均值进行强度归一化，因子为10,000。然后，使用24个运动回归变量的模型以及通过主成分分析从白质和平均脑脊液信号中识别出的五个噪声信号进行噪声变量回归。通过对配准的结构MRI图像应用FSL的FAST工具计算白质和脑脊液的脑掩膜。通过使用FSL FLIRT的基于边界的配准实现功能到解剖的配准。然后对噪声变量回归的残差进行带通滤波，随后使用6毫米FWHM核进行平滑。最后，使用ANTs通过线性和非线性配准将预处理后的fMRI时间序列空间归一化到MNI152空间。

静息态fMRI连接图绘制

为了与小鼠数据保持一致，通过应用上述相同的全局连接图绘制方法来量化fMRI连接性。然后使用ComBat对所有数据采集库的全局连接图进行标准化。在进行亚型划分之前，将自闭症参与者的fMRI全局连接图针对神经典型参与者的fMRI连接图的均值和标准差进行体素级z分数归一化，以根据神经典型参与者解释自闭症诊断参与者的连接模式，即连接增加或减少。

使用fMRI连接进行自闭症亚型划分

使用归一化的全局连接图，基于图3总结的跨物种区域方法，发现自闭症亚型。具体来说，搜索自闭症个体的归一化全局连接图，显示与在小鼠亚型中观察到的模式相对应的fMRI低连接或高连接模式。为了建立跨物种的区域对应关系，选择了13个皮层和皮层下区域，这些区域先前被描述为具有合理的啮齿动物解剖和功能前体。这些包括联合和边缘皮层，如内侧前额叶、前扣带回、中扣带回和压后皮层（即小鼠默认模式网络的细胞结构保守成分）、岛叶皮层和初级躯体感觉区。皮层下结构包括纹状体、丘脑、杏仁核、下丘脑和海马。小鼠脑的解剖区域边界通过艾伦小鼠脑参考图谱定义，人脑的解剖区域边界通过哈佛牛津图谱定义（补充图2a）。用于跨物种fMRI亚型划分流程的更详细说明见补充图1。首先使用两个小鼠亚型各自的联合图生成低连接和高连接的“连接异常先验”。对于每个联合图，测量了在13个区域的每一个中显示出低连接或高连接的体素百分比。通过对这13个区域的百分比应用k-means聚类，将连接异常更突出的脑区与连接异常较不突出的脑区分开。该策略导致识别出5个具有显著低连接的脑区——即前扣带回、中扣带回、脑岛、运动皮层和纹状体（补充图2b）。将这些区域聚合到一个聚合的小鼠低连接掩膜中。对于啮齿动物高连接亚型，识别出3个具有显著高连接的脑区，即杏仁核、海马和纹状体（补充图2b），并将它们聚合到如上所述的小鼠高连接掩膜中。接下来使用这两个掩膜指导人类数据集中低连接和高连接亚型的识别。在属于低连接掩膜的区域中表现出fMRI连接低于1个标准差的自闭症谱系参与者被分组到低连接亚型（补充图1）。类似地，在与啮齿动物高连接掩膜同源的区域组中表现出fMRI连接高于1个标准差的自闭症诊断参与者被分组到高连接亚型（补充图1）。为了排除亚型可能由扫描仪内头动区分，测量了两个亚型中每个个体的帧间位移。组均值比较证实了亚型间同样低的头动水平（补充表1）。

亚型划分的可重复性

为检验此研究fMRI亚型的可重复性，此研究事先将自闭症个体队列分为一个发现数据集和一个重复数据集，并使用相同方法独立地在两个数据集中寻找亚型。为创建发现和重复数据集，此研究使用R函数'group_by'，遵循以下条件：(1) 两个数据集必须在诊断、性别、年龄和扫描仪内头部运动方面仔细匹配；(2) 其中一个数据集至少包含70%的样本。最终匹配的数据集包括发现数据集中78.5%的脑扫描（n = 744名自闭症参与者，n = 807名神经典型参与者，n = 38个数据收集批次）和重复数据集中21.5%的脑扫描（n = 196名自闭症参与者，n = 229名神经典型参与者，n = 38个数据收集批次）。连续变量年龄（t₁,₉₇₄ = 1.09，P = 0.28）和扫描仪内头部运动（t₁,₉₇₄ = 0.10，P = 0.92）通过未配对t检验确认了发现和重复数据集之间的匹配，分类变量如诊断（χ²₁ = 0.45，P = 0.49）和性别（χ²₁ = 1.82，P = 0.18）则通过χ²检验确认。随后，对于聚类到低连接亚型和高连接亚型的自闭症个体，其全局连接得分相对于神经典型组的分布进行z标准化，发现和重复数据集合并处理。接着，在13个进化保守区域对z标准化后的全局连接值进行量化（补充图2c,d）。

可重复性通过发现和复制数据集中识别的两种亚型的fMRI脑图之间的空间相似性度量来评估。具体来说，量化了在每个亚型的fMRI连接图经过阈值化和二值化处理后获得的联合图之间的Dice系数（低连接亚型：补充图3a；高连接亚型：补充图3c）。还通过计算未阈值化图的空间相关性评估了可重复性（低连接亚型：补充图3b；高连接亚型：补充图3d）。最后，为了排除亚型划分可能被少数实验室采集的脑扫描所偏倚，在移除了包含最多自闭症参与者的数据采集库后，在聚合样本中重复了上述亚型划分。

功能网络图绘制 

为了研究与每个亚型相关的fMRI网络非典型性，使用NBS计算了网络内部和网络之间的fMRI连接性。为此，首先从Schaefer图谱的400个皮层分区和与FSL一起分发的Harvard Oxford图谱的14个皮层下分区中提取fMRI时间序列。Schaefer皮层区域根据相关文献分组到七个规范静息态功能连接网络中。然后使用时间Pearson相关性计算每个脑扫描的ROI到ROI功能连接矩阵。接下来，跨参与者回归掉全脑平均连接信号。这一步允许评估每个亚型图的网络组织，超越表征两种自闭症亚型的一般高连接和低连接。最后，使用NBS中实现的非配对t检验来识别每个亚型内自闭症个体与神经典型个体之间的组间功能连接差异。使用FWER对多重比较的统计结果进行校正。将单变量阈值设为t≥3.1，网络显著性设为P=0.05（双尾），并进行了5000次置换。这为每个亚型生成了一个组水平的功能连接矩阵，显示了在网络内部和网络之间存活的NBS统计阈值的ROI到ROI fMRI连接的绝对数量。考虑到功能网络具有不同的大小，通过网络内部和网络之间的总ROI到ROI fMRI连接数对功能连接矩阵进行了归一化。使用R包'circlize'中实现的功能连接图显示每个亚型的网络级fMRI连接差异。

行为分析

为了研究自闭症连接亚型是否可以通过自闭症行为表型进行区分，使用了与ADOS-2一致的评分。使用ADOS作为主要度量，因为其临床有效性、特异性和广泛使用。重点关注总CSS。此外，为了评估对总CSS有贡献的症状的潜在变化，还检查了子量表“社交情感”和RRB的CSS。CSS的范围从1到10，分数越高表示严重程度越高；它们允许在不同ADOS模块之间进行比较，这些模块因年龄和语言能力而异。使用这些分数来描述聚合样本，并用于识别的自闭症相关脑连接异常亚型的组均值比较。

对于在ADOS-2（参考文献119）发布之前收集和汇总的ABIDE数据，总校准严重度评分（CSS）是在每个数据收集点内，根据Gotham等人（针对模块2和3）和Hus与Lord（针对模块4）提出的基于自闭症诊断观察量表-通用版（ADOS-G）相关条目的相应算法计算得出的。因此，在本研究中，汇总样本中包含自闭症诊断标签的940例数据中，有n = 549（58.4%）可获得总CSS。这些数据包括来自CMI的所有n = 63例数据、ABIDE I的一个子集（n = 9个数据收集批次：KKI、NYU、UCLA-1、UCLA-2、UM-1、UM-2、USM、Stanford和Yale）以及ABIDE II的一个子集（n = 11个数据收集批次：GU-1、IP-1、KKI-1、NYU-1、NYU-2、OHSU-1、SDSU-1、SU-2、U-MIA-1、UCD-1和UCLA-1）。为考察自闭症表型亚领域的作用，此研究根据Hus与Lord的指南，将可用的社会情感和限制性重复行为（RRB）子量表标准分转换为相应的CSS。自闭症组中有n = 520（55.3%）的个体可获得社会情感分数，n = 525（55.8%）的个体可获得RRB分数。采用未配对t检验（经FDR多重比较校正，q ≤ 0.05）评估亚型组间行为分数的均值差异。二次分析探讨了亚型在人口统计学、智商分数、精神共病发生率及精神药物使用情况方面的比较（补充表1）。

为检验这些亚型的fMRI图是否表现出与认知功能相关的脑图相似的空间拓扑结构，此研究使用了参考文献中确定的12个本体概率图。与参考文献一致，空间对应性被测量为每个神经认知图在P < 1 × 10⁻⁵阈值下的体素与每个亚型在Cohen's d ≥ 0.2下的平均回归功能磁共振成像图重叠的体素比例(%)。由此产生的空间对应关系用雷达图进行可视化。

大脑解码与基因富集化分析

为了在两种自闭症亚型的fMRI连接图中搜索自闭症相关的遗传特征，进行了脑解码和基因富集分析。这些分析的目的是测试与两种亚型的fMRI图空间相关的基因表达模式是否在自闭症中差异表达。为了识别在每个亚型特征性的连接异常模式中空间富集的基因，使用NeuroVault进行了脑解码。该分析首先使用混合线性模型计算未阈值化的全脑fMRI图与艾伦研究所人脑基因表达图谱中六个供体大脑的基因表达空间模式之间的相似性。这些供体特异性线性模型的斜率编码了每个基因的空间表达模式与fMRI图的相似程度。然后对供体特异性斜率进行单样本t检验，以识别其空间表达模式在供体大脑之间与fMRI图一致显示高相似性的基因。随后对得到的基因列表进行多重比较阈值化，仅保留t统计值在FDR q<0.05下存活的基因用于后续富集分析。为了增加基因表达与两种自闭症亚型fMRI脑图之间空间特异性的相似性，仅保留了在大脑中高表达的基因。该分析为低连接亚型产生了一个基因列表，为高连接亚型产生了一个基因列表。接着，过滤掉两个列表中都存在的基因，以保留那些在任一列表中独有表示的基因。这分别得到了低连接和高连接亚型的基因。这一步使后续研究能够专注于与每个连接异常亚型独特相关的通路。有了分离的fMRI相关基因列表，然后进行了一系列基因富集分析，以检查fMRI转录组特征是否富集了特定的分子通路。这些组中的第一组包含在自闭症中差异表达的基因。该列表通过聚合所有下载的与研究小鼠大脑时相同的人类自闭症相关同源通路的本体论生成的。在此，还包括了对一个手动整理的突触基因列表（“SynGO”）的基因富集分析。最后，探究了第三组基因的富集情况，这次包括标记有已知生物学功能的基因共表达模块。通过使用超几何统计检验测量富集度，并用OR和P值量化。在多重比较校正FDR q<0.05下存活的基因被认为具有统计学显著性。脑解码基因和通路列表在补充表3中报告。